第一節(jié)免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念

1、 第一節(jié)第一節(jié) 免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念免疫標(biāo)記技術(shù)的基本概念一、免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫的概念二、常用的免疫標(biāo)記物質(zhì) 免疫標(biāo)記與免疫標(biāo)記與標(biāo)記免疫標(biāo)記免疫免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)：標(biāo)記物與免疫活性物質(zhì)的聯(lián)接技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)：以標(biāo)記免疫物質(zhì)檢測(cè)相應(yīng)靶物質(zhì)的技術(shù)常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別 標(biāo)記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測(cè)定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測(cè)定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測(cè)定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測(cè)定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白

2、免疫組化 免疫分析測(cè)定 第二節(jié)第二節(jié) 酶標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與鑒定常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、常用酶 辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 堿性磷酸酶（AP）2、標(biāo)記方法 戊二醛交聯(lián)法 過(guò)碘酸鹽氧化法戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 (一步法）一步法）抗體-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗體酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶戊二醛交聯(lián)法（二步法）戊二醛交聯(lián)法（二步法）COH-（CH2）3-COH + NH2-酶抗體-NH2 +

3、 CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶過(guò)碘酸鹽氧化法過(guò)碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+ NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環(huán)標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析2、鑒定 抗體活性 酶活性 標(biāo)記物純度 第三節(jié)第三節(jié) 熒光標(biāo)記技術(shù)熒光標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、熒光素的概念2、生物標(biāo)記熒光素的要求3、常用熒光素標(biāo)記原理與方法 生物標(biāo)記熒光素的要求生物標(biāo)記熒光素的要求1、具

4、有與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的能力2、熒光效率高3、能與背景物質(zhì)形成鮮明對(duì)比4、不影響蛋白質(zhì)的生物、免疫活性5、標(biāo)記方法安全、簡(jiǎn)便6、標(biāo)記物穩(wěn)定，易保存FITCFITC的標(biāo)記原理與方法的標(biāo)記原理與方法熒光素-N=C=S + NH2-抗體熒光素-N-C-N-抗體H S HRB200RB200的標(biāo)記原理與方法的標(biāo)記原理與方法熒光素-SO3Na + PCl5熒光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl熒光素-SO2 Cl + NH2-抗體 熒光素-SO2 -NH-抗體 + HCl 標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離熒光素 方法：柱層析2、鑒定 抗體活性 標(biāo)記物結(jié)合度 F/

5、P比值的應(yīng)用意義 第四節(jié)第四節(jié) 放射性核素標(biāo)記技術(shù)放射性核素標(biāo)記技術(shù)一、常用標(biāo)記方法二、標(biāo)記免疫物的分離與純化常用標(biāo)記方法常用標(biāo)記方法1、常用放射性核素2、125I 的標(biāo)記方法 直接法（氯胺T法） 間接法（連接法）直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T間接法（連接法）間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+ Na125I氯胺T125INSHPP間接法（連接法）間接法（連接法）CH2OHOH-C

6、-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白質(zhì)H O H+ NH2-蛋白質(zhì)125I125I標(biāo)記免疫物的分離與鑒定標(biāo)記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離放射性核素 方法：柱層析2、鑒定 游離放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）應(yīng)用意義本章小結(jié)本章小結(jié)1、免疫標(biāo)記技術(shù)的概念2、常用免疫標(biāo)記物質(zhì)及其標(biāo)記方法3、標(biāo)記免疫物質(zhì)的分離與鑒定思考題思考題1、何謂免疫標(biāo)記技術(shù)？2、常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)有哪些？3、酶標(biāo)記的主要方法有哪些？4、F/P比值的實(shí)用意義如何？5、何謂比放射性？有何意義？ 第一節(jié)第一節(jié) 標(biāo)記免疫技術(shù)的分類標(biāo)記免疫技術(shù)的分類一、按指示

7、標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型二、按測(cè)定方式劃分的類型三、按測(cè)定用途劃分的類型1、酶免疫技術(shù)2、熒光免疫技術(shù)3、放射免疫技術(shù)4、發(fā)光免疫技術(shù)5、金免疫技術(shù)按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型按指示標(biāo)記物質(zhì)劃分的類型1、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按測(cè)定方式劃分的類型按測(cè)定方式劃分的類型均相型（均相型（homogenous）非均相型（非均相型（heterogeneous）雙標(biāo)記均相熒光免疫測(cè)定雙標(biāo)記均相熒光免疫測(cè)定酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)1、免疫測(cè)定技術(shù)2、免疫組化技術(shù)按測(cè)定用途劃分的類型按測(cè)定用途劃分的類型 第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、EL

8、ISA技術(shù)的原理與方法二、 ELISA技術(shù)的操作注意要點(diǎn)ELISA技術(shù)的原理與方法技術(shù)的原理與方法間接法 夾心法 競(jìng)爭(zhēng)法間接法間接法夾心法夾心法競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀ELISA技術(shù)的操作注意要點(diǎn)技術(shù)的操作注意要點(diǎn)試劑器材操作環(huán)節(jié) 合適工作濃度 第三節(jié)第三節(jié) 熒光抗體技術(shù)熒光抗體技術(shù)一、熒光抗體技術(shù)的原理與方法二、熒光抗體技術(shù)的操作注意要點(diǎn)熒光抗體技術(shù)的原理與方法熒光抗體技術(shù)的原理與方法直接法間接法補(bǔ)體法雙標(biāo)記法 直接法間接法補(bǔ)體法雙標(biāo)記法熒光抗體技術(shù)的操作注意要點(diǎn)熒光抗體技術(shù)的操作注意要點(diǎn)標(biāo)本處理染色操作 結(jié)果觀測(cè)熒光顯微鏡熒光顯微鏡熒光顯微鏡使用原理熒光顯微鏡使用原理激發(fā)濾片（

9、BG）吸收濾片（OG）標(biāo)本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC發(fā)射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650激發(fā)濾片激發(fā)濾片吸收濾片吸收濾片熒光濾鏡使用原理熒光濾鏡使用原理 第四節(jié)第四節(jié) 放射免疫測(cè)定技術(shù)放射免疫測(cè)定技術(shù)一、放射免疫測(cè)定技術(shù)的原理與方法二、放射免疫測(cè)定技術(shù)的操作注意要點(diǎn)結(jié)合相游離相放射免疫分析法的原理與方法放射免疫分析法的原理與方法1 2 5 10 20 50 10040302010未標(biāo)記抗原含量未標(biāo)記抗原含量結(jié)結(jié)合、合、游游離離相相放放射射性性含含量量比比值值液閃儀液閃儀計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)器放射免疫測(cè)定技術(shù)的操作注意要點(diǎn)放射免疫測(cè)定技術(shù)的操作注意要點(diǎn)反應(yīng)的溫度與時(shí)間結(jié)合相與游離相的分離免疫標(biāo)記技術(shù)的比較免疫標(biāo)記技術(shù)的比較 FIA ELISA RIA敏感性 較低 高 高特異性 高 高 高重復(fù)性 差 好