西華師范大學生命科學院

1、西華師范大學生命科學院遺傳學實驗教學大綱王祖秀20072一 教學目的與要求 遺傳學為生物學各專業(yè)的必修基礎(chǔ)課之一。 本課程主要通過動物、植物、微生物為材料，從個體、細胞、分子水平揭示遺傳學的基本現(xiàn)象與規(guī)律。通過遺傳學實驗，使學生加深對遺傳學基本原理的理解。同時使學生熟練掌握經(jīng)典遺傳學的研究方法與技術(shù)。學習和掌握部分現(xiàn)代遺傳學的實驗操作與技能，熟悉遺傳學的分析方法，培養(yǎng)學生分析問題的能力。 本實驗課內(nèi)容主要包括驗證性實驗和綜合性實驗。全部實驗均在教師指導下，由學生自己動手完成。顯微鏡觀察內(nèi)容，均采用顯微鏡示范和顯微圖片示范相結(jié)合的方式。使學生能高效、準確地識別觀察內(nèi)容。對實驗結(jié)果不成功的學生，要

2、求分析其原因。二 遺傳學實驗及學時分配(實驗總學時34)實 驗 名 稱學時數(shù)實驗一植物有絲分裂的制片與觀察2實驗二人體染色體核型分析及輻射誘變?nèi)旧w畸變的觀察2實驗三大蔥減數(shù)分裂的制片與觀察3實驗四果蠅形態(tài)、性狀、性別、生活史的觀察及雜交實驗技術(shù) 2實驗五果蠅唾腺染色體制片與觀察3實驗六小鼠骨髓細胞染色體制片與觀察 4實驗七動物染色體分帶技術(shù)3實驗八植物基因組DNA的提?。▌?chuàng)新實驗）4實驗九DNA的凝膠電泳（創(chuàng)新實驗）4實驗十隨機擴增多態(tài)DNA（RAPD）技術(shù)（創(chuàng)新實驗）5實驗十一人群中P.T.C味盲及ABO血型基因頻率的分析2 三 教學內(nèi)容 實驗一 植物有絲分裂的制片與觀察(一) 實驗原理

3、在各種生長旺盛的植物組織中，包括：孢原組織、根尖、莖尖以及愈傷組織、分化的小孢子、萌發(fā)的花粉管，常進行著細胞分裂。經(jīng)過適當?shù)娜〔奶幚?，加以固定、離析、染色、涂抹壓片，可以迅速的將細胞分散附著在載玻片與蓋片之間。然后進行有絲分裂過程中染色體動態(tài)變化的觀察。遺傳學上，通過細胞有絲分裂的觀察研究染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和計數(shù)，是進行核型分析、鑒別雜種等常駐機構(gòu)用的基本方法。(二) 實驗目的 1觀察染色體在有絲分裂中的動態(tài)變化過程，識別有絲分裂各個時期特點，加深對有絲分裂遺傳學意義的理解。 2 學習和掌握對植物組織、細胞的固定、離析和觀察植物根尖有絲分裂的壓片方法。(三) 實驗材料 蠶豆(四) 實驗器具與試

4、劑 1 器具 恒溫水浴箱、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、50ml燒杯、鑷子、刀片、鉛筆、吸水紙、擦鏡紙 2 試劑 95%乙醇、冰醋酸、1NHCl、改良苯酚品紅(五) 實驗步驟 1 取材 用刀片切取0.51.0cm的蠶豆側(cè)根根尖; 2 固定 取下的根尖用3:1的乙醇冰醋酸卡諾氏固定液固定30分鐘; 3 解離 酸解法1) 將材料水洗吸干后,放入60的1NHCl中解離8分鐘,用水充分漂洗后制片。解離的目的是軟化細胞,使細胞便于分散。 酸解法2） 將材料放入95%乙醇：濃HCl= 1：1的解離液中在室溫下解離8分鐘, 用水充分漂洗后制片。 4 染色壓片 將漂洗后的根尖置于載片中央，用刀片切取分生區(qū)細胞少許，

5、滴上一滴染液，蓋上蓋片，染色1015分鐘。用鉛筆頭輕輕敲打蓋片，使細胞分散。 （六） 觀察與繪制有絲分裂各時期圖實驗二 人體染色體核型分析(一) 實驗原理 任何一種生物的細胞都有一定數(shù)目、一定大小和形態(tài)的染色體，便構(gòu)成了生物體特有的核型。核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型。包括染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)的總和。不同的生物，其核型是不同的。核型分析是在對有絲分裂中期染色體進行測量、計算的基礎(chǔ)上，進行配對，按一定原則編號（從大到小）、分組、排列，并進行形態(tài)分析的過程。核型分析可以為細胞遺傳分類、物種間親緣的關(guān)系、以及染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的研究提供重要依據(jù)。因此，在細胞遺傳研究領(lǐng)域中具有重要意義。

6、(二) 實驗目的 了解核型分析的過程，學習核型分析的方法。(三) 實驗材料 正常男人、正常女人的染色體照片(四) 實驗器具 毫米尺、計算器、剪刀、鑷子、膠水（制作染色體標本片的器具見人體外周血培養(yǎng)技術(shù)，攝影顯微鏡、放大機、相紙、暗室設(shè)備等。）（五） 實驗步驟1 正常男人、正常女人的染色體標本片顯微觀察選染色體形態(tài)好、分散好、且完整的細胞進行顯微攝影沖洗膠卷放大成照片（教師準備）2 對照片上分散的染色體隨機編號，測量、記錄每條染色體的長臂、短臂、臂比、全長和相對長度。相對長度=每條染色體的長度/單倍染色體組長度（2n總長度/2）X100臂比=長臂長度/短臂長度（q/p）3 配對 根據(jù)測定的每條染

7、色體的相對長度和臂比，將大小和形態(tài)相近的兩條染色體配對成一對同源染色體。4 分類和排序染色體的分類根據(jù)Levan（1964）的分類標準，根據(jù)臂比大小不同分成：m、sm、st、t四類。根據(jù)相對長度的大小，將配對后的染色體從大到小編號排序。附人類正常男人的核型圖:人體染色體核型分析數(shù)據(jù)表染色體編號相對長度長臂短臂臂比染色體類型染色體編號相對長度長臂短臂臂比染色體類型113214315416517618719820921102211X12Y實驗三 大蔥減數(shù)分裂的制片與觀察 (一) 實驗原理 進行有性繁殖的生物,都要通過減數(shù)分裂形成配子。減數(shù)分裂過程中，染色體復制一次，細胞連續(xù)分裂兩次。因此，通過減數(shù)

8、分裂形成的配子中的染色體數(shù)目減半。由2N變成N。減數(shù)分裂過程中，染色體要發(fā)生一系列的變化。在適當時機采集植物花蕾，經(jīng)固定后，取花蕾中的花藥制片，就可在顯微鏡下觀察到染色體在減數(shù)分裂中的行為和變化過程。(二) 實驗目的 1 觀察染色體在減數(shù)分裂中的行為和變化過程，識別減數(shù)分裂各個時期特點，加深對減數(shù)分裂遺傳學意義的理解； 2 掌握觀察植物減數(shù)分裂的制片技術(shù)。(三) 實驗材料 大蔥花序(四) 實驗器具與試劑 1 器具 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、解剖針、鑷子、吸水紙、擦鏡紙 2 試劑 95%乙醇、冰醋酸、改良苯酚品紅(五) 實驗步驟 1 取材：在2-3月份，摘取1.52.0cm大小的大蔥花序;2 固定

9、: 取下大蔥花序用3:1的乙醇冰醋酸卡諾氏固定液固定24小時后轉(zhuǎn)入70%的酒精中保存.3 制片: 取大小適當?shù)幕ɡ?用解剖針剝出花藥,將花藥置于載片中央,滴上一滴染液,用鑷子挾破花藥,擠出花粉母細胞，除去大塊雜質(zhì)，蓋上蓋片。(六) 觀察并繪制大蔥減數(shù)分裂各時期細胞圖實驗四 果蠅形態(tài)、性狀、性別、生活史的觀察及雜交實驗技術(shù)(一) 實驗原理 果蠅是雙翅目昆蟲,它具有生活周期短（25培養(yǎng)，兩周一個世代，）；繁殖力強（每只雌果蠅一生中可產(chǎn)400只卵）、數(shù)量大；個體小、易培養(yǎng)；可見形態(tài)突變性狀多等優(yōu)點，因此，果蠅是用作遺傳實驗極好的材料。后來還發(fā)現(xiàn)果蠅不僅染色體數(shù)目少，2N=8，還具有巨型的唾腺染色體，

10、是進行細胞遺傳研究的極好材料。因此，對果蠅形態(tài)及生活史的了解具有重要意義。(二) 實驗目的 1觀察果蠅生活史中各個階段形態(tài)特征,掌握果蠅培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的制備； 2 正確區(qū)分果蠅雌雄和幾種常見的突變性狀； 3 掌握觀察果蠅性狀的麻醉技術(shù);4 進行果蠅雜交實驗的實驗步驟及注意事項。(三) 實驗材料 5個果蠅品種(四) 實驗內(nèi)容 1 觀察果蠅生活史： 全變態(tài)昆蟲： 卵 幼蟲 蛹 成蟲 培養(yǎng)溫度對生活周期長短的影響 培養(yǎng)溫度 10 15 20 25 卵 幼蟲： 8天 5天 幼蟲成蟲： 57天 18天 6天 4天 2 雌雄性別的鑒別區(qū)別雌性雄性1）體大體?。?）腹部橢圓、末端稍尖；腹部末端鈍圓；3）成

11、蟲腹部背面有5條黑色細條紋；成蟲腹部背面有2細1粗的3黑條紋；4）腹部腹面有6個腹片腹部腹面有4個腹片5）第一對胸足附節(jié)基部無性梳第一對胸足附節(jié)基部有性梳6）肛上板簡單（白色）肛上板復雜（褐色） 附: 野生型果蠅圖 雄性() 雌性()3 常見的幾種突變性狀 野生型： 長翅（+） 紅眼（+） 直剛毛（+） 灰身（+） 殘 翅： 殘翅（vg） 紅眼（+） 直剛毛（+） 灰身（+）黑檀身： 長翅（+） 紅眼（+） 直剛毛（+） 灰身（e）白 眼： 長翅（+） 白眼（w） 直剛毛（+） 灰身（+） 三隱性： 小翅（m） 白眼（w） 焦剛毛（sn） 灰身（+）4 果蠅麻醉技術(shù):（深麻與淺麻）5 果蠅培養(yǎng)

12、基的制備 玉米培養(yǎng)基配方水瓊脂蔗糖玉米粉酵母汁丙酸75ml1.5g13.5g10g1勺0.5ml6 果蠅雜交實驗步驟 1）選雜交用的親本果蠅：用作母本的雌果蠅一定要是處女蠅； 2）在25培養(yǎng)7天后，倒去親本果蠅，等待F1的羽化； 3）培養(yǎng)14天，觀察記錄F1果蠅的性狀，制備新培基，將F1轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基中，讓其自交； 4）實驗第21天，倒掉F1，等待F2果蠅的羽化； 5）實驗第28天，觀測統(tǒng)計F2的類型和數(shù)目,對實驗結(jié)果進行c2檢驗, 判斷結(jié)果是否符合遺傳規(guī)律。實驗五 果蠅唾腺染色體的制片與觀察(一) 實驗原理 唾腺染色體是存在于雙翅目昆蟲唾腺細胞內(nèi)的一種巨型染色體。它是DNA經(jīng)多次復制（500-

13、1000）而不分開所形成的。因此，又叫多線染色體。它在細胞學上有四大特點：1 大；2 同源染色體緊密配對；3 具有染色中心；4 具著色深淺不同、寬窄不同的橫紋。四對染色體共有5000多條帶紋。每條染色體的橫紋是恒定的，是識別染色體的重要標記，是進行細胞遺傳學研究的極好材料。染色體的四在結(jié)構(gòu)變異都是通過唾腺染色體發(fā)現(xiàn)的。(二) 實驗目的 1 學習觀察唾腺染色體的制片方法；2 觀察唾腺染色體的結(jié)構(gòu)特點和在細胞遺傳學研究中的重要意義。(三) 實驗材料 果蠅三齡幼蟲（培養(yǎng)基中多放酵母，在17-20培養(yǎng)）(四) 實驗器具與試劑 1 實驗器具 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、解剖針、吸水紙、擦鏡紙。 2 試劑 甘

14、油蛋白、0.7%生理鹽水、1N HCl、蒸餾水、苯酚品紅（P208）、無水乙醇、Eupara（牛派膠）(五) 實驗步驟 1 滴甘油蛋白涂片； 2 取唾腺：選一條大且活動的三齡幼蟲于載片的中央，滴一滴生理鹽水，兩手條握一枚解剖針，一枚按住幼蟲前1/3處固定不動，一枚按住幼蟲頭部用力向前拉，唾腺隨之而出。然后根據(jù)半透明、囊狀認識唾腺，除去雜質(zhì)。3 1NHCL處理唾腺2-3分鐘（使組織松散,便于壓片）后,用蒸餾水沖洗兩次；4 用苯酚品紅染色10-15分鐘；5 壓片：垂直用力，切勿搓動蓋片；(六) 鏡檢觀察并繪制唾腺染色體圖（附果蠅唾腺染色體）實驗六 小鼠骨髓細胞染色體制片與觀測(一) 實驗原理 在骨

15、髓細胞中，有絲分裂的指數(shù)是很高的。因此，可以直接得到中期細胞而不必像淋巴細胞或其它組織細胞那樣經(jīng)過無菌培養(yǎng)。主要的中期相來自成紅細胞，也來自自各種骨髓母細胞。通過骨髓得到染色體無需無菌操作。采用直接法從骨髓中取出細胞，經(jīng)滴片、空氣干燥，可以得到較好的染色體標本片，供細胞遺傳分析用。(二) 實驗目的 1 學習用骨髓細胞制備動物染色體標本片； 2 觀察小鼠染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和雌雄間的染色體差異(三) 實驗材料 65-90天齡的年青小白鼠(四) 實驗器具與試劑 1 器具 2ml注射器、5號針頭、5ml離心管、吸管、試管架、載片、離心機、顯微鏡、剪刀、鑷子、量筒、燒杯2 試劑 100微克/ml的秋水仙素

16、液、2%檸檬酸鈉、0.075KCl、冰醋酸、甲醇、Giemsa原液、0.01M磷酸緩沖液(PH6.8)(五) 實驗步驟 1 秋水仙素處理：取骨髓前4小時先給小鼠經(jīng)腹腔注射秋水仙素0.8ml。2 取骨髓：用斷髓法迅速處死小鼠，用解剖剪剪掉大腿上的皮膚和肌肉，取出完整股骨，用2%檸檬酸鈉洗干凈，剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭，露出骨髓腔。用吸有適量檸檬酸鈉液的注射器從股骨的一端插入注射針頭，將骨髓吹入離心管，反復吹洗數(shù)次，直至股骨變白為止。離心管中的細胞懸液可達4.5ml。3 低滲處理 將所獲細胞懸液經(jīng)1000rpm離心10分鐘,吸去上清液,加入0.075MKCl 4.5ml, 立即將細胞團吹散打勻,在

17、室溫下靜止25分鐘。 4 固定 低滲處理后的細胞經(jīng)1000rpm離心10分鐘，吸去上清液，沿管壁加4.5ml 3:1的甲醇冰醋酸固定液,立即吹散細胞團,使其在固定液中懸浮均勻。靜止固定30分鐘后離心,去上清液,重復固定一次。當?shù)诙喂潭ê箅x心,去上清液,再加入1:1甲醇冰醋酸固定液進行第三次固定,20分鐘后,離心去上清液,然后加入1:1甲醇冰醋酸2-3滴,搖勻制成細胞懸液.5 滴片 取事先在冰水中預冷的載片,滴一滴細胞懸液于粘有冰水的載片上,立即吹散細胞,將染色體裝片自然干燥.6 染色 將染色體裝片反扣在染色板上,用5%Giemsa染色液進行扣染20分鐘,(六) 觀察小鼠染色體的特征,并繪制染

18、色體圖 附小鼠染色體圖片 小鼠染色體實驗七 動物染色體分化染色技術(shù)(C-帶)(一) 實驗原理 C-帶是最簡單的一種帶。70年代用原位雜交的方法證明,C-帶區(qū)是結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)。染色體標本經(jīng)酸處理,使DNA脫嘌呤。堿處理產(chǎn)生一個高水平的DNA變性，促進DNA溶解。用2XSSC鹽溶液處理使DNA骨架斷裂并使斷片溶解。而異染色質(zhì)區(qū)DNA對抽提有較大的抗性，保留了部分DNA，用Giemsa染色出現(xiàn)深染帶。(二) 實驗目的 學習C-帶分帶技術(shù)和顯帶原理。(三) 實驗材料 小鼠染色體標本片(四) 實驗器具及試劑 1 實驗器具 燒杯、量筒、恒溫水浴箱、臥式染缸、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙 2 試劑 0.2MHCl

19、,5%Ba(OH)2, 2XSSC鹽溶液，Giemsa原液、0.01M磷酸緩沖液(PH6.8)五 實驗步驟 1 酸處理 取5-7天齡的染色體標本片,在0.2MHCl溶液中處理15-20分鐘,蒸餾水沖洗;2 堿處理 將標本片放入染缸中,然后加入預熱到50飽和Ba(OH)2溶液,處理10分鐘后,用50的自來水染缸中的Ba(OH)2充分沖洗;3 鹽處理 將標本片放入2XSSC的鹽溶液中,在60溫浴30分鐘.4 染色 用10%Giemsa染液扣染10分鐘,用自來水輕輕沖洗，自然干燥。5 鏡檢觀察并繪制染色體C-帶圖實驗八 植物基因組DNA的提取(一) 實驗原理 DNA的提取是為了得到DNA的樣品,以供

20、進一步的研究用.一般用酚氯仿將組織中蛋白質(zhì)等鞭它物質(zhì)從DNA中分離出,從而得到DNA。DNA提取的方法依實驗的材料和提出來取的目的DNA不同有所不同。如：動物組織DNA的提取、植物DNA的提取、質(zhì)粒DNA的提取等。(二) 實驗目的 學習植物基因組DNA的提取方法。(三) 實驗材料 韭蘭（Z. grandiflora var）葉片 (四) 器具與試劑 器具: 15ml離心管、玻棒或牙簽 試劑：8M 脲， 0.35MNacl、 0.05MTris-HClPH 8.0，0.02MEDTA，2%蔗糖，5%酚, 10%SDS, 氯仿,異戊醇, 3M醋酸鈉, TE或雙蒸水溶解試劑的配制見附錄I(五) 實驗

21、步驟 1 取2克新鮮的葉片在液氮中研成粉末,放入15ml離心管中,加入5mlDNA提取緩沖液(8M脲,0.35MNacl,0.05M Tris-Hcl PH8.0,0.02MEDTA,2%蔗糖,5%酚),用玻棒攪勻. 2 加入1.5ml 10%SDS,倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使之混勻,60保溫10分鐘,其間倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次. 3 從60水浴中取出,離心分相,吸取上清液入一新的離心管中. 4 向上清液中加入等體積的氯仿: 異戊醇(42:1)混勻,離心,吸取上清液. 5 重復上次步驟,至上下相間無沉淀物. 6 向上清液中加入1/10體積的3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷乙醇或2/3體積的異丙醇,用玻棒或牙簽纏出

22、DNA,室溫下晾干. 7 將帶有DNA的玻棒或牙簽放入15ml的離心管中,加入適量的TE或雙蒸水溶解,4貯存?zhèn)溆?實驗九 隨機擴增多態(tài)DNA（RAPD）技術(shù)(一) 實驗原理RAPD(randon amplified polymorphicDNA)是90年代發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性分子標記的方法，由于它快速、簡便，已廣泛用于動植物學領(lǐng)域中，是檢測親源關(guān)系、群體遺傳學研究，檢測種群內(nèi)、種群間遺傳多態(tài)性、進行種、亞種或種群鑒別的有效手段，在構(gòu)建遺傳位點圖譜和為未來研究發(fā)現(xiàn)變異位點上具有潛在的應用。RAPD的基本原理是：模板DNA在94解鏈變性后，在一定的溫度下（35-37，低于40）根據(jù)堿基互

23、補的原則，單個引物退火到基因組DNA模板兩條不同的位置上，在有足夠的DNA聚合酶活性的條件下，dNT從引物的3端滲入,接上與模板互補的種種單核苷酸,產(chǎn)生一段新的互補DNA鏈.如果基因組DNA分子上一段距離內(nèi)沒有反向平行與引物相互補的位點,則擴增的產(chǎn)物只呈線性增加,電泳和染色難以檢測到.當互補的兩條鏈上引物結(jié)合位點在彼此可擴增的中距離內(nèi)(一般為200-2000bp),通過40過循環(huán)的聚合酶鏈反應就可以把該區(qū)內(nèi)(200-2000bp)的DNA片斷實現(xiàn)240倍的擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離和溴化乙錠染色后可直接在紫外燈下觀察和照相,得到的電泳圖譜帶可作為DNA指紋做多態(tài)性分析.(二) 實驗目的 學習RA

24、PD擴增的原理和分法.(三) 實驗材料 韭蘭葉片 (四) 儀器與試劑 1 儀器: 移液管, PCR儀,小型臺式離心機,旋渦混合器,電泳儀,水平電泳槽, 2 試劑: 10堿基隨機引物,GC含量為50-70%; 緩沖液(10XBuffer)、Mgcl2、dNTPs(2.5Mm for each)、TapDNA聚合酶。 3 模板DNA：為得到最佳效果，模板DNA要盡可能純，必要時可用RNase處理總DNA粗制品，提取后，乙醇沉淀，最后DNA溶于0.1XTE緩沖液中,并稀釋至1-100ng/ul.(五) 實驗步驟 1 反應體系（單位ul）（更大體積需要適當延長變性及退火時間）。10XBufferMg2

25、+dNTP引物模板DNA雙蒸水TapDNA酶石蠟油總計42.422227.40.2(1unit)2滴40 注: a.為使加樣準確,可將反應物需要Buffer、Mg2+、dNTP一次性取出混勻，再分到離心管中。 b、TapDNA酶也一次性取出所需總量與水混勻，再分成所需等份到各個離心管中，酶液可在預變性后再加入到反應體系中。 c、上述操作均在無菌臺操作，嚴禁污染，所用一次性移液頭、離心管、雙蒸水、石蠟油需高溫滅菌。2 反應程序 （1）94預變性4 min； （2）94變性1 min；（3）37復性1 min；（4）72 Cy延伸2 min；（5）重復2-4步驟40個循環(huán)；（6）72保溫10 mi

26、n；立即于0.7%1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測或置于4冰箱. 3 電泳分離 由于瓊脂糖凝膠電泳簡便易行,故一般用瓊脂糖凝膠電泳檢測RAPD產(chǎn)物,溴化乙錠(EB)染色,在305nm紫外線光照下擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)橙紅色熒光. 注意: 1) EB為強致癌物質(zhì),所有操作需帶上次性手套. 2) 盡量縮短點樣時間,以免樣品擴散. 3) 紫外線有傷害眼睛的作用,驗測時應注意保護. 4 統(tǒng)計分析 1) 根據(jù)可重復性實驗及空白對照實驗確定哪些是人為變異,去偽存真,在某一位置上擴增產(chǎn)物“有”記為“1”，“無”記為“0”。 2）根據(jù)F=2Nxy/（Nx+Ny）計算遺傳距離，其中Nxy為兩樣品共有帶數(shù)，Nx、Ny分別為x、y

27、樣品的總擴增帶數(shù)。 3）根據(jù)遺傳距離構(gòu)建種系發(fā)生樹（） 方法：spss/pc 軟件包中的組內(nèi)（組間）平均連鎖（within/between-group average linkage）法；MEGA（molecular evolution and geneticanalysis）中的非加權(quán)組平均（UPGMA）法和最近距離（NJ）法，RAPDist軟件等，其中RAPDist軟件則是專為公析RAPD數(shù)據(jù)編寫的。實驗十 DNA的瓊脂糖凝膠電泳(一) 瓊脂糖凝膠電泳的特點 在分子生物學實驗技術(shù)中，瓊脂糖凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA的主要方法之一，所用的電泳槽有垂直、圓盤和水平三種，以水平槽最為常駐機

28、構(gòu)用。在電場中，PH=0.8的條件下，凝膠中帶負電荷的DNA向陽極遷移。不民濃度的瓊脂糖凝膠可以分離從200bp到50kb的DNA片段。在瓊脂糖凝膠中加入低濃度的溴化乙錠（ethidum bromide，EB）即可在紫外線下檢測出10ng的DNA條帶。在使用過程中，可邊電泳邊觀察，而且在取出后，還可以放回去繼續(xù)電泳。如有必要，還可以從凝膠中回收DNA條帶，供進一步實驗所需。(二) 影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素 1）DNA分子的大小 在凝膠基質(zhì)中，絲狀雙鏈DNA遷移速率與其堿基對數(shù)目的常用對數(shù)值呈反比，分子越大，摩擦阻力亦越大，遷移越慢。2）瓊脂糖濃度一個特定大小的DNA片段，其遷移速

29、率在不同濃度的瓊脂糖中各不相同。DNA電泳遷移速率的對數(shù)與凝膠濃度成線形關(guān)系。采用不同濃度的瓊脂糖凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子（見下表）不同濃度瓊脂糖凝膠的線形DNA分離范圍凝膠中瓊脂糖含量%（W/V）線狀DNA分子的有效分離范圍（kb）0.36600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.232.00.12 3) 電壓 在低電壓時, 線狀DNA片段和遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，高分子量DNA片斷的遷移率將以不同的幅度增長，因此，隨電壓和增加，瓊脂糖凝膠上有效分離范圍縮小。要使大于2kb的DNA 片段的分辨率達到最大，瓊脂糖凝膠上所加電壓不應

30、超過5V/cm。 4）堿基組成與電壓溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受到DNA的堿基組成和凝膠電泳溫度的影響不明顯。故在瓊脂糖凝膠電泳中，不同大小DNA的片段相對遷移率在430之間不發(fā)生明顯的變化，瓊脂糖凝膠電泳一般在實溫下進行。但濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠和低熔點瓊脂糖凝膠較為脆弱，最好在4下電泳。 5) 嵌入染料的存在 溴化乙錠用于檢驗員測瓊脂糖中的DNA,會使線狀DNA的遷移率降低15%.染料嵌入到堆積的堿基之間,并拉長線狀和帶切口的環(huán)狀DNA,使剛性更強. 6) 離子強度的影響 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率.在無離子存在時(如使用蒸餾水配制凝膠)電導率最

31、小,DNA幾乎不移動; 而在高離子強度的緩沖液中(如誤用了10X電泳緩沖液),電導很高并明顯產(chǎn)熱,嚴重的會引起凝膠熔解而DNA發(fā)生變性.天然雙鏈DNA的常駐機構(gòu)用電泳緩沖液有TAE、TBE、TPE等，通常配成濃縮液，貯存于室溫，用前稀釋。(三) 實驗目的 學習和掌握DNA的凝膠電泳的原理和方法。(四) 實驗材料 韭蘭葉片DNA (五) 儀器與試劑 1 儀器：穩(wěn)壓穩(wěn)電泳儀、水平電泳槽、紫外透射儀、照相機（配有紫外和橙色濾色鏡）。 2 試劑：瓊脂糖、載樣緩沖液 電泳緩沖液溴乙錠（EB）(六) 實驗步驟1 洗凈并晾干電泳裝置所配備的塑料盤,用膠帶將其兩端開口封住,置水平工作臺(最好用水平儀校正2 根

32、據(jù)朽木不槽的容積和需要配制的濃度,準確稱量適當?shù)沫傊?轉(zhuǎn)入三角瓶中,加入需量的1X電泳緩沖液(見附錄I)。三角瓶容量不可過小，一般配的膠量不能超過容量的50%。3 在三角瓶燒瓶口上松松地包上一層厚紙，置沸水浴或微波爐中將懸浮液加熱到瓊脂糖溶解。注意不可直接在明火上加熱，在微波爐中加熱時間要控制好，防止沸出。4 待瓊脂糖凝膠溶液冷卻至60。需要時加入溴化乙錠（用水配成10%的貯存液）至終濃度為0.5%，輕輕搖勻，防止出現(xiàn)氣泡。5 趁熱將瓊脂糖凝膠溶液倒入已封好的電泳槽塑料盤中，凝膠厚度在35mm之間，插入適當?shù)氖嶙?。為防止封口處滲漏，可在倒膠前用一支玻璃吸管吸少量凝膠溶液均勻涂于封口上。6 待

33、凝膠完全凝固后，小心移去梳子和膠帶紙，放入盛有1X電泳緩沖液的電泳槽中。注意：低溶點瓊脂糖凝膠和濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠冷卻至4，并在冷室中電泳。7 向電泳槽中補足電泳緩沖液至恰好沒過凝膠面約1mm。8 取適量（通常為35微升）DNA樣品與23微升載樣緩沖液混勻，用移液管將混合后的樣品輕輕點入瓊脂糖凝膠的孔中。已知分子量大小的DNA標準參照物應同時加在凝膠的左、右兩側(cè)孔內(nèi)，在凝膠電泳中出現(xiàn)系統(tǒng)性畸變時，易于確定未知DNA的分子量大小。測量未知DNA分子量大小時，所有樣品均需要使用相同的載體緩沖液。9 蓋上電泳槽的蓋，按電泳的起始端接負極，另一端接正極接通電源，DNA在這樣的條件下，由負極向

34、正極電泳。打開電泳儀開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至15V/cm（按兩極距離計算）。如接線正確，則會在陽極和陰極處產(chǎn)生氣泡（由于發(fā)生電解），數(shù)分鐘后，溴酚藍從加樣孔中遷移到凝膠中。繼續(xù)電泳至溴酚藍在凝膠中遷移到適當距離。電泳過程中，溴化乙錠向陰極移動（與DNA相反），延長電泳時間會使溴化乙錠從凝膠中遷移出來，令小片段DNA難以檢測，可在溴化乙錠溶液（0.5%）中染色3045分鐘。10 關(guān)掉電源，打開槽蓋，帶一次性手套取出凝膠，置紫外透射儀上，在紫外線下檢測電泳情況。11 攝影在紫外透射儀上，用照相機記錄電泳結(jié)果。市售紫外燈的光源發(fā)射波長大多為302nm，溴化乙錠與DNA的復合物在這一波長下的熒光產(chǎn)生率遠遠高于

35、366nm處而略低于短波長（254nm）處。用高效的外線外光源（2500UW/cm2）、一塊紫外濾色鏡、一塊橙色濾色鏡及性能良好的鏡頭（=135cm）在光圈為5。6時日曝光數(shù)秒就可以攝出含有10ngDNA的條帶。延長曝光時間并采用強紫外光源，可在膠片上記錄到僅1ngDNA所發(fā)射的熒光。按標準方法沖洗膠卷?，F(xiàn)國內(nèi)一些實驗室有較先進的凝膠成像系統(tǒng)，可以免去沖洗膠卷和放大照片的過程，直接在熱敏打印機上打印出質(zhì)量很高的照片來。附錄I：常用溶液的配制：1 1M Tris：取121.1g Tris堿，溶于800ml水，用濃鹽酸調(diào)PH至所需值所需 PH值： 7.4 7.6 8.9濃鹽酸大約用量： 70ml

36、60ml 42ml 定容至1000ml,高壓蒸氣滅菌.2 0.5mM2.2H2O，溶于800ml水，置于磁力攪拌器上激烈攪拌，邊攪拌邊加顆粒NaOH,至PH8.0(約用20gNaOH)，分裝，高壓蒸氣滅菌。3 5M Nacl：取 292.2gNacl，溶于800ml水，定容至1000ml，分裝，高壓蒸氣滅菌。4 3M NaAc（PH5.2）：取408gNaAc.3H2O，溶于800ml水，定容至1000ml，分裝，高壓蒸氣滅菌。5 10%SDS: BC 100g電泳純SDS(十二烷基磺酸鈉)， 溶于900ml水，置68加熱助溶,滴加濃鹽酸至PH7.2,定容至1000ml，分裝。6 10mg/ml溴化乙錠（EB）：取1Geb，懸于100ml水，置于磁力攪拌器上攪拌數(shù)小時以完全溶解，置暗色棕色瓶或包裹鋁箔的瓶中在4儲存。7 TE溶液：PH7.4: 10mM Tris.(PH7.4),1mM EDTA(PH8.0)PH7.6: 10mM Tris.(PH7.6),1mM EDTA(PH8.0) PH8.0: 1