實驗室污染防治

1、.PCR污染的產(chǎn)生及防治污染的產(chǎn)生及防治分子生物學(xué)技術(shù)平臺討論會PCR系列之一2008-2-28.PCR污染的監(jiān)測污染的監(jiān)測 PCR強(qiáng)大擴(kuò)增能力強(qiáng)大擴(kuò)增能力+檢測的敏感性檢測的敏感性經(jīng)經(jīng)30個周期后，特定個周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加片段的數(shù)量在理論上可增加109倍倍極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對定量造成很大的問題極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對定量造成很大的問題NTCNTC (No Template Control): (No Template Control): 必須必須設(shè)置一個不含模板設(shè)置一個不含模板DNA但含有但含有PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對系統(tǒng)中所有其他成分的對

2、照反應(yīng)，這一對照管須在準(zhǔn)備好所有其他照反應(yīng)，這一對照管須在準(zhǔn)備好所有其他PCR以后才進(jìn)行吸加。以后才進(jìn)行吸加。 .常見的常見的PCR contamination 常規(guī)常規(guī)PCR 熒光定量熒光定量PCRNTC432176598NTC.引起引起PCR污染的原因污染的原因 模板間交叉污染模板間交叉污染容器被污染模板放置時, 由于密封不嚴(yán)溢于容器外容器外粘有模板而造成相互間交叉污染模板吸取過程中, 因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器污染，從而導(dǎo)致交叉污染.引起引起PCR污染的原因污染的原因 PCR試劑污染試劑污染PCR 試劑配制過程中, 移液器、容器、水等原因造成試劑被PCR 核酸模板污染

3、。.引起引起PCR污染的原因污染的原因 PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染-最主要最常見最主要最常見PCR 產(chǎn)物拷貝量大，極微量的PCR產(chǎn)物污染, 就可形成假陽性。移液器吸取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，同一支移液器去準(zhǔn)備PCR mixPCR產(chǎn)物的氣溶膠污染： 一個氣溶膠顆?？赡芎瑤兹f個拷貝氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質(zhì)中粒徑一般為 0.001m1000m的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系?？諝馀c液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠, 在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管, 開蓋時、吸樣時及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠.引起引起PCR污染的原因污染的原因 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染實驗室中克隆質(zhì)粒的污染克隆質(zhì)粒濃度

4、高, 另外在純化過程中需用較多的用具及試劑, 其污染可能性也很大.防止防止PCR污染污染首要原則首要原則 永遠(yuǎn)要設(shè)置永遠(yuǎn)要設(shè)置NTC對照對照 如果不能在污染出現(xiàn)的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致嚴(yán)重的如果不能在污染出現(xiàn)的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果：一大段時間的數(shù)據(jù)不可信后果：一大段時間的數(shù)據(jù)不可信 準(zhǔn)備準(zhǔn)備PCR的移液器要專用的移液器要專用 千萬不能千萬不能用吸取用吸取PCR產(chǎn)物產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備PCR 體系體系.防止防止PCR污染污染空間：空間： 合理分隔實驗區(qū)域:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR

5、產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。 理想狀態(tài)：理想狀態(tài)： 各個區(qū)域?qū)嶒炗闷芳耙埔浩鲗Ｓ?，實驗前?yīng)將該區(qū)域用紫外線消毒，破壞殘留的DNA或RNA。.防止防止PCR污染污染操作操作一旦進(jìn)入吸加PCR試劑的專用場所并開始工作，就應(yīng)戴上一副新手套，并應(yīng)勤于更換。準(zhǔn)備專供自己使用的PCR試劑，分裝為小份。不要與樣品存放在一起。選擇質(zhì)量好的Eppendorf管-密封性好且開管不需要太大力氣打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。實驗結(jié)束后及時清理臺面.防止防止PCR污染污染移液器操作移液器操作由于操作時不慎將模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣時要

6、十分小心。1）準(zhǔn)備PCR的移液器專用2）吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。3）最好在加完所有其他反應(yīng)成分后才吸加模板。4）推薦在準(zhǔn)備PCR過程中使用濾芯槍頭. 選用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶 Uracil-N-Glycosylase)的試劑，有助于防止PCR產(chǎn)物引起的污染。UNG：50攝氏度，2分鐘，作用于含有dU的DNA雙鏈或單鏈然后開始PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟，同時UNG失活防止防止PCR污染污染對于不含dU的PCR產(chǎn)物無效.出現(xiàn)污染后解決辦法出現(xiàn)污染后解決辦法更換試劑更換試劑 更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用更換新的試劑

7、和水，用確保無污染的移液器分裝備用清潔所有可能的污染源：實驗臺面、小離心機(jī)、冰箱門把手等等清潔所有可能的污染源：實驗臺面、小離心機(jī)、冰箱門把手等等 1）實驗臺面、超凈工作臺用現(xiàn)配的）實驗臺面、超凈工作臺用現(xiàn)配的3%雙氧水或雙氧水或10%次氯酸鈉次氯酸鈉溶液擦拭清潔。溶液擦拭清潔。 2）或者用）或者用10%漂白粉溶液擦拭漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過90 cm，照射時間最好過夜。，照射時間最好過夜。實驗過程中更加小心，采用前面提到的各種防止污染的辦法實驗過程中更加小心，采用前面提到的各種防止污染的辦法.參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn) Kwok S ,Higuchi R. Avoiding false positives with PCRJ . Nature ,1989 ,339 (6221) :237 - 238. Mifflin T.E. Setting Up a PCR Laboratory. CSH Protocols; 2007; doi:10.1101/pdb.top1