采用多種抗原測定靜注人免疫球蛋白(pH4)中抗體Fc段生物學活性的初探.docx

1、論著.采用多種抗原測定靜注人免疫球蛋白(pH4)中抗體Fc段生物學活性的初探席亮，錢秋娟，張繼鵬,趙一歡，劉曉，何彥林(蘭州生物制品研究所有限責任公司甘肅省疫苗工程技術研究中心，蘭州730046)摘要：目的初步探討采用多種抗原測定靜注人免疫球蛋白(IVIG)(pH4)中抗體的Fc段生物學活性，了解IVIG中抗體的Fc段生物學活性。方法采用補體活化的經(jīng)典途徑中免疫復合物激活補體的方法，將不同濃度的麻疹病毒、風疹病毒、乙肝表面抗原(HBsAg)、破傷風類毒素、腦膜炎球菌P64k外膜蛋白和白喉類毒素6種抗原分別致敏人0型血紅細胞形成紅細胞-抗原結(jié)合物;然后,6種致敏紅細胞分別與IVIG孵育，與特異性

2、抗體形成紅細胞-抗原-抗體復合物;最后,此復合物與補體反應，在541nm波長處讀取吸光值，并繪制溶血反應動力學曲線,分別計算IVIG中針對上述6種抗原IgG的Fc段生物學活性。采用此方法，用6種抗原致敏的紅細胞測定IVIG的Fc段生物學活性10次，驗證此方法的重復性。結(jié)果麻疹病毒、風疹病毒、HBsAg、破傷風類毒素和腦膜炎球菌P64k外膜蛋白致敏的紅細胞分別與供試品和補體反應后，測定的溶血反應動力學曲線較平緩，而白喉類毒素致敏的紅細胞與供試品和補體反應后，測定的溶血反應動力學曲線下降明顯，呈典型的“S”型曲線。計算結(jié)果顯示,IVIG中針對此六種抗原的抗體Fc段生物學活性相對于參考品均大于80%

3、。Fc段生物學檢測方法重復性較好。結(jié)論采用多種抗原分別致敏紅細胞，可以用來檢測1VIG中多種抗體的Fc段生物學活性，為深入了解IVIG制品中的多種抗體的Fc段生物學活性奠定了基礎。關鍵詞：抗原;靜注人免疫球蛋白;Fc段;生物學活性中圖分類號：R392.33文獻標志碼：A文章編號：1005-5673(2012)06002505DeterminationonbiologicactivityofFcfragmentinintravenousimmunoglobulin(pH4)byusingmultipleantigensXILiang,QIANQiu-juan,ZHANGJi-peng,ZHAOY

4、i-huan,LIUXiao,HEYan-lin(LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd,9CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,China)Abstract:ObjectiveTodeterminebiologicactivityofFcinIVIG(pH4)byusingdifferentantigensfandtounderstandbiologicactivityofFcfragmentofvariousIgGinIVIG(pH4).Methods

5、TheclassicalcomplementactivationwascarriedoutindetermininationbiologicalactivityofFcfragmentinIVIG(pH4)byusing6differentantigenscoupled-tannedredbloodcells(RBC),respectively.FirstfItisbypreparationofmeaslesvaccines,rubellavaccinesfHBsAg,tetanustoxin,P64koutermembraneproteinofMeningococcusanddiphther

6、iatoxincouplingtoRBCrespectively.ThenIVIGwereaddedtotheantigencoupledRBCtoformacomplex(antigensensitizedRBCandantibody).Finally9thecomplementwasaddedtothecomplex.MeasurementbiologicactivityoftheFcwasbymeansofdetectionin541nmandmakingcurvesforhaemolysis.Analysiswasperformedfor10timesbyusing6different

7、antigenwithdifferentconcentrationcoupledRBCfrespectively.VerificationwascarriedoutinconfirmationoftherepetitionforbiologicactivityofFcinIVIG.ResultsThehaemolysiscurveswereinslopelinesfor5differentantigens(measlesvaccines,rubellavaccinesfHBsAg,tetanustoxin,andp64kproteinonoutermembraneproteinofMening

8、ococcus)coupledRBC.However,haemolysiscurvefordiphtheriatoxoidcoupledRBCwasverytypicalandformedaclassical"S"curve.ThebiologicactivityofFcfragmentinIVIGcouldreachtomorethan80%byusingof6differentantigensincomparisonof收稿日期：201210-17；修回日期：2012-11-05referencematerials.Thetestforrepetitionofbiolo

9、gicactivityof作者簡介:席亮(1970-),男，醫(yī)學生物學工程師，主要從事生物FcinIVIGwasinanormalrange.ConclusionDetermination制品質(zhì)量保證工作。onbiologicactivityforFcfragmentinIVIGwasattemptedby通信作者:劉曉,E-mail：boylxl006usingmultipleantigensinthisstudyfwhichprovidedaprimarybasisinthisaspect.Keywords：Antigens;IntravenousImmunoglobulin(IV1G);

10、Fcfragment;Biologicactivity靜注人免疫球蛋白主要成分為IgG。IgG最主要的生物學功能是對微生物的調(diào)理作用。調(diào)理作用是微生物特異結(jié)合的抗體通過完整的IgG的Fc段與吞噬細胞的Fc受體結(jié)合，形成抗原抗體吞噬細胞的復合物，促使吞噬細胞對微生物的吞噬。所以，正常的調(diào)理作用需要IgG識別吞噬細胞表面Fc受體，這首先要求IVIG中IgG要有完整的Fc段生物學活性。另外JVIG對自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)機制也往往通過Fc段來完成,包括效應細胞Fc受體的競爭性抑制、抑制性FcyRflB受體的誘導及FcRn受體飽和作用等。因此,IVIG的Fc段在體內(nèi)能否發(fā)揮良好的生物學活性與臨床療效

11、密切相關。生物制品的生物學功能應通過臨床試驗來證實，但是一些體外檢測指標也能間接證實其生物學活性。為體外檢測IVIG制品臨床應用的有效性,1997年歐洲藥典已將1VIG的Fc段活化補體的功能作為質(zhì)控指標來考核制品的質(zhì)量。中華人民共和國藥典）2010年版三部也已介紹了Fc生物學活性檢測方法。歐洲藥典和中華人民共和國藥典介紹的Fc段生物學活性的檢測方法基本一致，只能檢測針對某一種抗原的抗體Fc段生物學活性。這樣僅能了解IVIG中針對特定一種抗原的抗體生物學活性。為了解針對多種抗原抗體的Fc段生物學活性，一種途徑可以選擇多種抗原分別致敏紅細胞;第二,可以選用多種抗原的混合物致敏紅細胞;另外，可以采用

12、IgG的Fc能夠與吞噬細胞表面的Fc受體結(jié)合的原理來測定IVIG中抗體的Fc段的生物學活性，此種方法能夠測定IVIG中所有抗體的Fc段生物學活性，這對于體外評價IVIG的有效性更有利。基于目前IVIG的Fc生物學活性檢測方法和實驗條件的限制，為了能夠觀察IVIG中針對多種抗原的抗體Fc段生物學活性，研究選用6種抗原分別檢測IVIG中抗體Fc段生物學活性，期望能更全面地了解IVIG中針對多種抗原IgG的Fc段生物學活性。1材料和方法1.1試劑與儀器磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氫氧化鈉、單寧酸（鞋酸）和氯化銘均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司；巴比妥鈉購自Sigma公司；

13、牛血清白蛋白購自上海伯奧生物科技有限公司;U-2001型紫外分光光度計為HITACHI公司生產(chǎn);ModelJ-6M型離心機購自Beckman公司；HZS-H型恒溫水浴振蕩器購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司;1VIG參考品為隨機抽取蘭州生物制品研究所有限責任公司（以下簡稱蘭州公司）生產(chǎn)的一批IVIG（pH4）以IVIG（pH4）國家標準品為參考品自行標定的工作標準品，批號為R20120503,蛋白含量為50g/L；麻疹疫苗和風疹病毒由蘭州公司疫苗一室提供;破傷風類毒素和腦膜炎球菌外膜蛋白P64k抗原由蘭州公司第一研究室提供；白喉類毒素由蘭州公司菌苗一室提供;乙肝表面抗原由蘭州公司血液制劑室保

14、存；人。型血由定西蘭生單采血漿有限公司岷縣站提供;補體采用豚鼠血清，由蘭州公司血液制劑室自行采集制備，補體效價為150CH50/mL；供試品為隨機抽取的蘭州公司生產(chǎn)的!VIC（pH4）o1.2方法1.2.1 6種抗原致敏紅細胞的最佳濃度優(yōu)化分別用原始濃度、2x稀釋和4x稀釋的6種抗原樣品致敏紅細胞，然后采用1.2.2介紹的方法測定其與補體反應的溶血反應動力學曲線，尋找抗原致敏紅細胞的最佳濃度。1.2.2 IVIG的Fc段激活補體的溶血反應動力學曲線測定依據(jù)文獻2介紹的方法,首先用20mLPBS（pH7.2）洗滌人。型血紅細胞3次，再用1.3mg/L糅酸糅化紅細胞，采用10%氯化銘將適當濃度的不

15、同抗原包被到紅細胞上，即為致敏紅細胞,致敏紅細胞濃度須在紫外分光光度計541nm處用牛血清白蛋白巴比妥緩沖液調(diào)節(jié)吸光值至1.0±0.1；按照表1的用量準確取供試品、參考品和陰性對照（陰性對照用牛血清白蛋白-巴比妥緩沖液代替）加入致敏紅細胞孵育30min,用牛血清白蛋白.巴比妥緩沖液洗滌3次，用0.8mL的牛血清白蛋白-巴比妥緩沖液重懸統(tǒng)細胞。于紅細胞懸液中加入75CH50/mL補體后，抗體Fc段就會與補體結(jié)合,引發(fā)補體反應，最終導致血細胞的細胞膜受到攻擊,血細胞破裂，釋放出血紅蛋白。加入補體后,立即在紫外分光光度計上541nm波長下記錄陰性對照、參考品和供試品的初始吸光值（4,）,然

16、后每分鐘記錄1次紫外吸光值（婦）。表1WIG的Fc段生物學活性測定各樣品的用量（mL）Tab.1VolumeofallsamplesusedindeterminationonFcfunctioninIVIG試驗組致敏紅細胞參考品供試品緩沖液補體參考品組0.10.9/0.2供試品組0.1/0.9/0.2陰性對照組0.1/0.90.2X參考品FC段生物學活性X100%時間A6424286陰性loooccibso-*-5(M)CCID5O-M-250CCID50141210810一陰性-1(MM)CC1D5O-5()OCC1D5M-M-2S0CCID500601201802403003r>04

17、2048。54060066072078084090()時間/s48642A：麻疹病毒;B：風疹病毒;C：乙肝表面抗原;D：破傷風類毒素;E：腦膜炎球菌P64k蛋白；F：白喉類毒素圖1使用不同濃度抗原致敏紅細胞與IVIG結(jié)合后分別與補體反應的A即時間（s）溶血反應動力學曲線Fig.1HaemolysiscurvesforinteractionbetweencomplexofdifferentantigenscoupledRBCandIVIGandcomplementbytime1.2.3IVIG的Fc段生物學活性的計算在Excel中制作出4“時間（s）的溶血反應動力學曲線，并計算出各曲線中相鄰三

18、點連接成直線的最大斜率S.P，并根據(jù)下述公式計算IVIG的Fc段生物學活性（IFc）。二供試品sy人一陰性對照sy4參考品Sex/1陰性曲線Sex/42結(jié)果2.16種抗原致敏紅細胞的濃度優(yōu)化結(jié)果在圖1AE中，麻疹病毒、風疹病毒、HBsAg、破傷風類毒素和腦膜炎球菌的P64k蛋白致敏的紅細胞與供試品和補體結(jié)合反應后，測定的溶血反應動力學曲線都比較平緩。而圖1F顯示，白喉類毒素致敏的紅細胞與同一供試品和相同濃度的補體反應后測定的溶血反應動力學曲線明顯下降，典型的“S”型曲線。從圖1可以看出,6種抗原分別以不同的濃度致敏紅細胞與補體的溶血反應動力學曲線有差別。IVIG的Fc段生物學活性測定方法要求測

19、定的溶血反應動力學曲線能夠計算出曲線相鄰三點的最大斜率即可用于計算Fc段生物學活性。麻疹病毒、風疹病毒、HBsAg、破傷風類毒素、腦膜炎球菌P64k外膜蛋白致敏的紅細胞與補體反應后測定的溶血反應動力學曲線較平緩，而白喉類毒素致敏紅細胞與補體的溶血反應動力學曲線呈典型的“S”型曲線。由于麻疹病毒、風疹病毒、HBsAg、破傷風類毒素和腦膜炎球菌P64k外膜蛋白5種抗原濃度的限制,試驗中以上5種抗原的濃度均采用最高濃度用于后續(xù)試驗。而白喉類毒素使用150Lf/mL,但是試驗沒有對更高濃度的抗原致敏紅細胞進行詳細的研究。2.26種抗原致敏的紅細胞測定IVIG的Fc段生物學活性結(jié)果表2為使用6種抗原致敏

20、的紅細胞測定供試品的Fc段生物學活性情況，結(jié)果顯示,6種抗原的致敏細胞檢測供試品的Fc段生物學活性結(jié)果均高于80%。但是測定的同一批樣品的Fc段生物學活性結(jié)果差別較大，可能是由于供試品中針對此類抗原的抗體滴度差別造成的。表2分別用6種抗原致敏的紅細胞測定WIG的Fc段生物學活性Tab.2TheresultsofbiologicalactivityofFcfragmentinIVIGbyusingdifferentantigenscoupledRBC抗原供試品Fc段生物學活性麻疹病毒117風疹病毒132乙肝表面抗原98破傷風類毒素82P64k蛋白118白喉類毒素1292.3采用6種抗原測定IVI

21、G的Fc段生物學活性的重復性.采用6種抗原致敏的紅細胞分別測定IVIG的Fc段生物學活性10次，以考察采用此方法測定IVIG的Fc段生物學活性的重復性，更進一步驗證結(jié)果的可靠性。表3所列數(shù)據(jù)顯示,6種抗原致敏的紅細胞測定IVIG的Fc段生物學活性結(jié)果較穩(wěn)定。表3采用6種抗原致敏的紅細胞測定IVTG的Fc段生物學活性試驗Tab.3TheresultsofbiologicalactivityofFcfragmentinIVIGbyusingdifferentantigenscoupledRBCintested試驗次數(shù)F。段生物學活也）麻疹病毒風疹病毒乙肝表面抗原破傷風類毒素P64k蛋白白喉類毒素1

22、1091349986109972108123878711298399109888010911441001129690107945113108868611189610912097921029671141089084107109811111883891061039104104828711410210951249181112101x±s106±6.1116±8.683±8.986±3.6109±3.4100±6.33討論20世紀40年代,Cohn-Oncley建立了適合工業(yè)化規(guī)模分離免疫球蛋白（IgG）的低溫乙醇法分離工藝，用該工

23、藝分離的IgG最初不能用于靜脈注射，原因是會產(chǎn)生嚴重的副反應。這種副作用主要是與制劑中存在抗補體活性（ACA）有關。隨后IVIG的研制工作開始關注防止、減少ACA方面。于是，應用胃酶或纖溶酶消化（酶解法）及化學修飾法減少ACA的方法相繼產(chǎn)生。但是，這些方法均會破壞IgG的結(jié)構完整性，因而降低了IVIG的療效。要作用。20世紀80年代，人們開始開發(fā)天然、完!應齊全，其含量與正常人血清IgG亞類分布相近，不=1IVIG的臨床療效與其生物功能密不可分,IgG分子的各個結(jié)構域在機體的免疫反應中均發(fā)揮著重的具有生物學效應的IVIG0理想的IVIG應具有與天然IgG相同的屬性,在制備IVIG過程中,IgG

24、亞類應破壞其生物活性。由于IVIG的生產(chǎn)工藝中很多工藝步驟會影響IgG的Fc段生物學活性，所以建立IVIG的Fc段生物學活性的檢測方法是十分必要的。國內(nèi)王誓舟等在2003年就已經(jīng)建立了檢測方法，該方法已經(jīng)在中華人民共和國藥典2010年版三部中收載，但是在IVIG的Fc段生物學活性日常檢測中還受到很多因素的影響,并且該方法僅能檢測IVIG中一種抗原特異抗體的Fc段生物學活性。為盡可能地全面了解IVIG中多種抗原特異抗體的Fc段生物學活性,研究分別采用麻疹病毒、風疹病毒、乙肝表面抗原、破傷風類毒素、腦膜炎球菌P64k蛋白和白喉類毒素6種抗原來測定蘭州公司生產(chǎn)的IVIGFc段生物學活性，為保證IVI

25、G質(zhì)量提供了參考依據(jù)。研究顯示,采用麻疹病毒、風疹病毒、乙肝表面抗原、破傷風類毒素和腦膜炎球菌P64k蛋白作為抗原，測定的溶血反應動力學曲線較平緩，可能因為IVIG中針對這些抗原的抗體水平較低。但白喉類毒素作為抗原測定的溶血反應動力學曲線下降明顯，是典型的“S”型曲線。通過計算,6種抗原的致敏細胞檢測供試品的Fc段生物學活性結(jié)果均高于80%o另外，在此基礎上,分別用6種抗原致敏的紅細胞檢測10次IVIG的Fc段生物學活性，結(jié)果顯示此檢測方法重復性良好。研究選用了6種抗原來檢測IVIG的Fc段生物學活性，國內(nèi)外有些學者也曾選用不同的抗原來進行檢測，但采用乙肝表面抗原和腦膜炎球菌P64k外膜蛋白為抗原致敏紅細胞測定供試品Fc段生物學活性的研究在國內(nèi)外還未見報道。Vroljak等使用破傷風類毒素作為抗原來檢測人免疫球蛋白的Fc段生物學活性，檢測方法準確度較高。王菁舟等研究了使用風疹抗原、麻疹抗原、流行性腮腺炎抗原和白喉類毒素檢測人免疫球蛋白的Fc段激活補體的功能，研究結(jié)果顯示，無論使用何種抗原，只要抗原效價為1：64J:128和1：256,所得的溶血反應動力學曲線均為一條直線，而用效價為1：512的抗原進行試驗得到較好的溶血反應動力學曲線。歐洲藥典推薦使用風疹病毒作為抗原來檢測,中華人民共和國藥典推薦致敏紅細胞的抗原使用白喉類毒素或流行性腮腺炎病毒，說明抗原的選擇應該考慮