霍亂毒素B亞基展示HIV-1 gp41 MPER表位的研究.docx

1、nor：10.3969/j.issn.1005-1678.2017.06.001霍亂毒素B亞基展示HIV-1gp41MPER表位的研究未祥'，張芝睛J邵佳二黃芳）齊家龍二高雙全之，李少勇2,李少偉1.2,夏寧邵1.2,顧穎I*（1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研完中心，福建廈門361102；2.廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，福建廈門361102）摘要目的評價霍亂毒素B亞基艘合HIV-1gf41MPER表位的免疫效果。方法利用霍亂毒素的B亞基（CTB）作為載體展示秘向于MPER的廣漕中和抗體2F5和4E10的表位。表達(dá)純化后的融合蛋白與

2、弗氏佐劑混合乳化后免疫小鼠，免疫4次后對小鼠的血清進(jìn)行綜合評價。ELISA法評價融合蛋白的免疫原性；檢測免疫血'清中IgA類抗體分析小鼠黏膜免疫應(yīng)答；對小鼠血清中的不同類型的抗體量進(jìn)行分析，通過流式細(xì)胞儀檢測PBMC細(xì)胞因子IFN-7和IL4用以分析小鼠免疫激活途徑；病毒中和實駿檢測免疫血清對病毒感染細(xì)胞的抑制能力。結(jié)果CTB作為載體蛋白具有很好的免疫原性，能修誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對MPER表位的抗體，剌激小鼠產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)針對MPER表位的IgA抗體。同時，融合蛋白可以刺激機(jī)體的IgCl,IgG2a和IgG2b類抗體的產(chǎn)生和刺激小鼠體內(nèi)的TH2類免疫途徑。中和實褒結(jié)果顯示，CT

3、BVE10免疫后的血清可以抑制NL4-3病毒對細(xì)胞的感染。結(jié)論CTB融合蛋白具有強(qiáng)免疫原性，可以刺激體液免疫反應(yīng)，黏膜免疫反應(yīng)和Th2類免疫途徑，并且CTB-4E10白免疫血清能夠抑制NU-3病毒感染紉胞。本研究為HIV-1gpllMPER作為候選疫苗的探索奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞HIV-1gp41MPER；霍亂毒素E亞基；免疫應(yīng)答中圖分類號R392.11文獻(xiàn)標(biāo)識碼AStudyonthecholeratoxinBsubunitdisplayingHIV-1gp41membrane-proximalexternalregionepitopeWEIXiang1,ZHANGZhi-qing2,SHAOJia

4、2,HUANGFang*,QIJia-long2,GAOShuang-quan2,LIShao-yong2,LIShao-wei1,2,XIANing-shao1,2,GUYing1,2A(1.NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentinInfectiousDisease,SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,Xiamen361102,China；2.StateKeyLaboratoryofMolecularVaccinologyandMolecularDiagnostics,SchoolofP

5、ublicHealth,XiamenUniversity,Xiamen361102,China)AbstractObjectiveToevaluatetheimmuneeffectoffusionproteinofCTBandHIV-1gp4IMPERepitope.MethodsThecholeratoxinBsubunitwasusedasacarriertodisplaytheepitopesofbNAbs2F5and4EI0targetingtheMPER.ThepuriHedfusionproteinswithFreundadjuvantwereimmunizedinmiceandt

6、heimmunizedserawereanalyzedafterthefourtimesimmunization.TheimmunogenicityofthefusionproteinswasanalyzedbyELISA.AndtheIgAantibodiesweredetectedtoevaluatethemucosalimmuneresponseinmice.Th(differenttypesofantibodiesandthecytokinesINF-、andIL-4ofPBMCwereusedtoevaluatetheimmuneresponsepathway.Besides,neu

7、tralizationassaywascarriedouttodetectedtheantiviralabilityofimmunizedserum.ResultsCTBasacarrierhasgoodimmunogenicityandfusionproteinscaninducedspecificantilxxiiesagainstMPERepitopes.Inaddition,thefusionproteinsstimulatedmucosa)immunity,inducedIgA,IgGl,IgG2aandIgG2l)antibodiesandtheH12immuneresponsep

8、athwayinmice.Importantly,CTB-4EI0immuneserumhadtheneutralizingactivityagainsttheNL4-3virus.ConclusionCTBfusionproteinshadgoodimmunogenicityandcouldinducehumoralimmunity,mucosalimmunityandTh2immuneresponsepathwayinmice.Theserumfrom'heCTB-4E10immunizedmicecouldinhibitvirusinfectingcells.Thisstudyl

9、aidthefoundationfortheexplorationofHIV-1gp41MPERascandidatevaccine.KeywordsUIV-Ig>41MPER；choleratoxinBsubunit；immuneresponse資助項目：國家自然科學(xué)據(jù)金（項目號81671645）作者簡介：未祥，男.碩士研究生在讀.研究方向：微生物學(xué)，E-mail：1525973431匈;顧穎，通信作者，女，博士，副教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)/細(xì)胞生物學(xué),E-mail：guyinge30多年來人們致力于研發(fā)能夠預(yù)防HIV-1病毒感染的疫苗，但是至今沒有成功。設(shè)計能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生

10、廣譜中和抗體的免疫原是疫苗研究的關(guān)鍵。在H1V-1病毒表面，ENV（gpl60）H聚體膜蛋白是唯一的免疫原。隨著近年來研究技術(shù)的突破,如單個B細(xì)胞分選，微量中和檢測等方法的應(yīng)用，越來越多的廣譜中和抗體被發(fā)現(xiàn)，目前已發(fā)現(xiàn)的廣譜中和抗體主要集中于ENV的六個靶點(diǎn)：可變區(qū)VIV2區(qū)5、ENV頂部的V3區(qū)、受體結(jié)合位點(diǎn)（CD4結(jié)合位點(diǎn)）3二即120和gp41交界面0”）、gp41的尷合肽和弟近病毒膜表面的MPER區(qū)川偵。在廣譜中和抗體作用的這些靶點(diǎn)中，MPER區(qū)位于"41的膜外區(qū)，而且靠近病毒膜。由于該區(qū)域保守性較強(qiáng)而且是線性表位，'富含酪敏酸,因此是H1V-1疫苗設(shè)計的理想表位。作

11、用于該位點(diǎn)的廣譜中和抗體主要有2F5,4E10.Z13e,10E8等。這些抗體作用于該位點(diǎn)能夠阻止病毒細(xì)胞膜上gp41的構(gòu)象改變吒，阻礙病毒膜與宿主細(xì)胞膜的融合，從而阻斷病毒感染宿主細(xì)胞。但MPER表位免疫原性較差并且疏水性較強(qiáng)”.在體外難以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。為了克服這些缺點(diǎn)，本研究中利用免疫原性較強(qiáng)且能形成五聚體的霍亂毒素B亞基（CTB）作為載體展示MPER的2F5和4EJ0表位，進(jìn)行小鼠免疫評價.探究HIV-1gp4lMPER作為候選疫苗的免疫效果，為HIV-1疫苗研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.I主要實臉儀器及試劑2F5和4E10（蘇州杰恩生物技術(shù)有限公司），弗氏佐劑（Sigma）

12、，羊抗鼠-HRP和羊抗人-HRP（Pierce公司）,Thl和Th2細(xì)胞因子檢測試劑（BDphanningeMouseThlTh2Th）7phenotypingkit）,Babl/C小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司），WB化學(xué)顯色底物;SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate（Thenno）o主要實驗儀器:酵標(biāo)儀（安圖生物r程股份有限公司）,FACSAria流式細(xì)胞儀（美國BD公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo電子有限公司），PCR儀（Biometra）。1.2融合蛋白的構(gòu)建及表達(dá)純化霍亂毒素B亞基（CTB）序列來源于GenbankKF664

13、567.1并在上海生工合成，來源于NL4-3病毒的2F5（ELLELDKWA）和4E10（LWNWF-DITNWL）表位序列經(jīng)過PCR鏈接到CTB的酸基端，同時在目的表位前插入CGGGSGGGGSGGGGS鏈接肽，使2F5和4E10表位更具有柔韌性。構(gòu)建好的序列插入到I70-T7載體上并轉(zhuǎn)入ER大腸桿渴進(jìn)行蛋白表達(dá)。、彳歐的濃度達(dá)到0.801）時用1mM異內(nèi)硫基-B-D-硫代毗喃半乳擄小（1PTG）在25T誘學(xué)表達(dá)12h0然后7000g離心收菌體并用裂解液（5mmol/LTris-HCl（pH7.2）.】mmol/LEDTA.30mmol/LNaCIJ重懸菌體,進(jìn)行超聲破碎（每500inL幽液

14、破碎3分鐘）。然后25OOOg離心10min留沉淀，目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。包涌體用含有0.5%X-triton100的buffer1（2mmol/LTris-HCl.O.5mmol/LEDTA.10mMNaCl）洗三遍，然后再用bufferf洗三道（每次都要充分懸?。?5000g離心10分鐘去上清，沉淀用8M的尿素重懸，之后分別用含有6,4.2,1,0M尿素的20mMTB8.0梯度透析使蛋白復(fù)性，梯度透析夏性的融合蛋白進(jìn)行15%SDS-PAGE鑒定，并且進(jìn)行WesternBlotting,使用的抗體分別為廣譜中和抗體2F5和4EI0。1.3小鼠免疫免疫用小鼠為8周齡Babl/C雌鼠,購買

15、于上海上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。免疫采用弗氏佐劑混合皮下注射，初次免疫用完全弗氏佐劑，免疫原用址為200jig,加強(qiáng)免疫佐劑為非完全弗氏佐劑.免疫原為lOOpig.每隔2周免疫1次.免疫4次后進(jìn)行眼球采血。37弋放置30min后高心取血清.血清在56Y滅活30inin后用于后續(xù)檢測。1.4酶聯(lián)免疫吸附（EL1SA）鑒定蛋門的活性和抗原的免疫原性使用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀矮抗原，終濃度為1mg/mL.稀釋后的抗原加入96孔板.100jjlL/孔并于37Y放置2h,之后用洗液洗一次并甩干，處理好的板加入封閉液（PBS,O.5%酪蛋白.2%明膠,0.1%防腐劑（prodin-300）200

16、孔并于37龍放置2h或者4Y過夜，然后將封閉液甩干并將板封存待用。使用20%NBS（含有20%的胎牛血清的PBS）稀釋待檢測的抗體或者血清,經(jīng)一定的梯度稀粹后加入到已經(jīng)包被抗原的96孔板中37P孵育1h.孵育好的板用洗液洗3次.充分洗去未結(jié)合的抗體,然后加入相應(yīng)的標(biāo)有HRP的酶標(biāo)二抗并于37弋孵育45min,再育完畢后用洗液洗去未結(jié)合的購標(biāo)二抗并用甩板機(jī)充分甩干，加入顯色底物顯色10n）in后2M硫酸終止反應(yīng)，檢測450nm吸光值。1.5小鼠T細(xì)胞因子分析小鼠PBMC的分離：100皿的小仗全血中加入Iml.的紅細(xì)胞裂解液（I0X紅細(xì)胞裂解液：8.3gNH4C1,1gKHCOj,0.037gED

17、TANa,5%»皂素,加dclH,0至100ml.pin.1-7.4）靜止45min使燈細(xì)胞充分裂斜，然后300g離心5min奔上清，細(xì)胞沉淀用PBS重懸并300g離心5min棄上清，敢復(fù)上述步驟2次,最后用PBS緩沖液重懸PBMC細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析:PBMC細(xì)胞的染色是根據(jù)BDphanningeMouseThlTh2Thl7phenotypingkit手冊進(jìn)行操作,紅細(xì)胞裂解后的PBMC用BDcytofixT.M緩沖液固定形態(tài).然后用perm/washTM緩沖液進(jìn)行細(xì)胞通透，最后用雞尾酒抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記并用BeckmanCyanADP流式細(xì)胞儀分析,數(shù)據(jù)的處理用Flowjo軟件分

18、析。1.6中和檢測使用感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞生產(chǎn)病毒,48h后收取細(xì)胞培養(yǎng)液上清3000rpm/min離心7min.取上清感染TZM-hl細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度的測定。經(jīng)過滅活的小俄免疫血清梯度稀釋后和100倍的TCID50病彪37Y孵育Ih.然后加入到含有約10'/孔TZM-bl細(xì)胞的96孔板中,37丁培養(yǎng)4048h后去掉孔中的細(xì)胞上清，并用含在1%甲醛和0.2%戊二醛的PBS固定液對細(xì)胞進(jìn)行固定.510min后用EBS緩沖液洗去固定液（洗3遍）.然后加入顯色液50心孔（配方為各20皿的200mM鐵離子和亞鐵離子，濃度為2M的鎂離子1皿,40mg/mL的X-gal10皿.加PBS

19、定容到1mL）：37°C顯色1h后川rnmunospotSeriesAnalyzer計數(shù)被病毒感染的細(xì)胞數(shù)2結(jié)果2.1免疫原設(shè)計及蛋白純化鑒定MPER表位位于HIVgMl的近膜端，并且具有高度的保守性.其中富含胳氛酸（圖IA和圖1B）。很亂毒素的R亞基（CTB）在非還原性的溶液中多數(shù)以五聚體的形式存在，本研究將靶向MPER的2F5和4E10表位融合到CTB上。并旦在表位的前端加入GGGGSGG（；GSCG（；（；S鏈接肽，使融合的表位具有柔性和保持其口然構(gòu)象.構(gòu)建融合蛋白CTB-2E5和CTB4EJ0,利用CTB增強(qiáng)表位的免疫原性（圖】C）。融合蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，通過

20、洗包涌體的方式進(jìn)行純化。純化結(jié)果如圖ID所示，蛋白大小在10-15kD&之間.在非還原狀態(tài)下，該蛋白多數(shù)以五聚體的形式存在，目.有部分的多聚體相叫<ElJ餅辿b歡I抵州JMfORL時儺濟(jì)旬14tTIM>I|.M|.*|><|MN|!iuw¥方.哩.皿H：<dN(a)|NIPIM>I|.M|.»|><|MM|I|UI?司|V|<I|(V)U4H|.M|.>|IA|MN|I|UIT3i|IIIIU.>*<|M/Ilimuui|'!>!我*Wl琳WH：4.m(H)u»K%WE(

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22、|MZIIlfUUIUIMIMMUd1101*11JJSM¥“也WW刑場winifiZi浦4$rvz|ULJ|pi°UuOU0III-HJ3也徊刃ZH，想叫WW網(wǎng)30血"琳州酉陽tti格岫叫41出（般哪卿咐）湘混,狄即加，牌?初仔丁州ooiM眼炊叩刈WV地%m伸弟啊砌計H：4<ihW"九如早客魂W碾就冰出的督裝可8湖I沖I黑浴廠“4部所網(wǎng)藻E而妃的W骨笑幼聊,1照酈游邸羽&O而戲？r蝴6UY謙汁卿聊刑場不彰我利茉啊山果叩的W刑毋BU:HI背郵咐好廣*坷£Mm遍尊林闊¥二執(zhí)皿卿黎|出w般濟(jì)沖加，"5解斟址3000

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25、HJ.：)/ixii|P»yund|hwii<h|.hui*u<>.».hjj州丑-*:drf«)9l-*sq)WUV<!W(u)sWi»MV«?/U»A；W(：>>,M«yKk4lH：4dK(H)sMM«lir«i-iihy)VMlMWoi:<t-nr>iUiK-iu:)MMJU*IHIo頃H；000：0£OPcsm.NJTKlo/類別的變化.七免疫前相比.2組免疫小鼠血清中l(wèi)g(；IJgG2a和心；21>都有很大程度的提高.但是免疫前后.

26、血清中的1攻；3抗體沒有變化。在這些IgG類抗體的變化中.CTB4E10效果明顯高FCTB-2F5免疫組(圖4A)另外.通過對gG2a與IgGI的比較發(fā)現(xiàn)融合蚩白免疫主要刺激小鼠的TH2類免疫途徑(圖4B)。這一結(jié)果在小的外周血細(xì)胞(PBMC)水平上也得到了驗證(圖4C和4D).2紋免疫小鼠TM類細(xì)胞因f(IFNr)兒乎沒有影響.但是與對照相比.'Fh2類細(xì)胞因有明顯的增加圖4由清抗體類別和T細(xì)眼因子檢測(A)血清抗體類則檢C和D)免修激活的途役分析!fA-y11.1類免帷途徑;IL4H12類免疫途徑Fife4l>rfr(fKinofantikidy-uMyfw*drwlTcel

27、l<*y1<>kinr*inimmunizr<lM*nim(A)Drh-tionMantilwMlyMihlypr*.(B.ClandI)AnalyMKIhrimmunrpathwayThI.inimunr|>alhway;II.-4.1112immunrpalh，a,2.5融合蛋n免疫血清對病能的抑制能力免疫血清對病毒的抑制能力是疫苗保護(hù)效果的關(guān)鍵指標(biāo).小IU4次免疫后的血清56,30min滅活后用于病毒的中和實.臉。使用的病毒為B亞旅的NU-3.89.6.C亞為的MJ4和D亞型的94UGI1420倍稀釋度姑評價免疫血清中和效果的最低稀釋倍數(shù)，小做血清稀降20倍

28、后對病推的中和結(jié)果如圖5所示.CTB-2F5免疫紋的小鼠血清對所有病毒均沒有中和能力.而CTBVE10免疫組有部分小鼠對B亞型的NIA-3有較弱的中和能力.對其他病毒姐沒有中和能力。CTB-2F5CTB-IEI0圖5清中和檢測Hg.5InununiMxl*rrumnenilralizationamqit3討論盡管HIV-IEnv包膜蚩白H有較羸的突變性JH.是也存在部分高度保守表位.如MPER表位.因此該友位是疫苗設(shè)計的理.想祀怵(H是該表位的疏水性和低免疫哽性阻砰r疫苗的發(fā)展盡管多數(shù)研究r<利用不同的萬法增強(qiáng)該&位的免疫原性如蚩白融合表位2,類病毒顆粒位示*.磷脂膜腿示0加等.

29、但是仍未能獲得廣譜中和的免疫血清或舌是抗體。本研究利用-種新型的載體蛋白CTB對MPEK的2F5和4E10表位進(jìn)行展示。CTB具有較高的免疫原性而且可以形成h.聚體增加MPER表位的免疫原性融合蚩白在大腸桿倘以包涵體形式發(fā)達(dá)，經(jīng)純化后在非還原性的SDS-PAGE中可以觀察到G聚體的存在,并且還有部分大Fh：聚體的多聚體存在。經(jīng)過WB的檢測.所&達(dá)的蛋白M以和相應(yīng)的抗體很好的結(jié)合.這說明這些畏位在該蜀白上有正確的構(gòu)象.抗體"I以正常識別純化的蛋門利用弗氏佐劑對小鼠進(jìn)行免疫.采用初免加強(qiáng)的策略經(jīng)過4次免疫后.血清檢測結(jié)果說明該融合步白JI有強(qiáng)免疫原性.可以刺激小鼠的免彼系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)

30、答和產(chǎn)生MPER特異性抗體CTB是霍亂毒素的B亞基,本身不具有毒性，而且研究表明.該蚩白可以刺激黏膜魚段反應(yīng)。黏膜免疫反應(yīng)對卜防止HIV的傳播有很威要的作用小鼠免疫血清IgA類抗體的檢測結(jié)果顯示，融合蚩白免疫后所有小鼠血清中部可以檢測到高滴度的IgA抗體.這說明該融合寇白可以刺激小鼠產(chǎn)生較好的黏膜免疫應(yīng)答另外.血清檢測的IgA抗體中含有MPER表位特鼻性IgA,但是不同的小鼠個體差異性較大仃效的免校"I以改變免疫細(xì)胞的微拜境.影響輔助性T細(xì)胞的分化.從而影響B(tài)細(xì)胞的分化和成熟對免疫后的血清分析發(fā)現(xiàn).CTB融合策白主要剌激小融IgGIJgG2a和lgG2b類抗體的反應(yīng)，而在免疫后幾F未

31、產(chǎn)生W；3類的抗體lpG2a與lg<；l的比例結(jié)果顯示CTB融合蛋白免疫后激活的主要是Th2免疫途徑.該結(jié)果與在細(xì)胞水*對Thl(IEN-7)和Th2(IL4)細(xì)胞因F的分析結(jié)果-致.融合蛋白免疫沒有影響TM免疫途徑。在抑制病母感染方面.CTR-2F5免疫血清對4種病嵌都沒有抑制能力.但是CTB4EI0免疫組有部分小M的免疫血清凹以抑制B亞型的NI4-3對細(xì)胞的感染由于目前發(fā)現(xiàn)的祀向MPEB的廣譜中和抗體都有自身反應(yīng)性('j細(xì)胞膜的反應(yīng)性).推測原因可能是MPER類廣譜中和抗體的產(chǎn)生需要細(xì)胞膜的輔助另外.廣譜中和抗體的產(chǎn)生需要較K時間發(fā)生抗體與病毒的共進(jìn)化和抗體親和力成熟因此，目

32、前仍未能通過MPER&位展示法免疫伏得廣諾中和抗體本研究利用機(jī)亂旋素B亞.筆(CTB)作為栽體展示MPER表位的研究.為后續(xù)HIV-1時MPER作為候選疫苗的探索奧定基礎(chǔ)09參考文獻(xiàn)1(-htvkleyMA.UittgcB(；.FtwdE().HIV-1rinrlo|>rgly(v<»|>nHtainbimynthcsiBvtrafficking,andincoqM>rationJJMolBiol.2011.410(4)：582-608.2HonsignoriM.H/angKK.(JimX.rtal.AiialK</arkwiallineup*M

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