補肝養(yǎng)髓方對老年性癡呆模型皮質(zhì)神經(jīng)元 RNA 和 Nissl 體的定量研究

1、補肝養(yǎng)髓方對老年性癡呆模型皮質(zhì)神經(jīng)元 RNA 和 Nissl 體的定量研究         【摘要】  目的：探討補肝養(yǎng)髓方對自發(fā)老年性癡呆模型皮質(zhì)神經(jīng)元 RNA 和 Nissl 體的影響。方法：從 21 月齡昆明種小鼠篩選出自發(fā)老年性癡呆（記憶障礙）鼠，隨機分為 4 組即空白對照組（老年性癡呆組）、西藥對照組、補肝養(yǎng)髓小劑量組、 補肝養(yǎng)髓大劑量組、另設(shè)老年學(xué)習(xí)記憶正常組（老年正常組）。用跳臺實驗檢測學(xué)習(xí)記憶成績；腦組織冰凍切片，細胞化學(xué)方法顯示大腦皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi) RNA 和 Nissl 體，全自動顯微圖像

2、分析系統(tǒng)定量檢測相關(guān)腦區(qū) RNA 和 Nissl 體含量。結(jié)果：補肝養(yǎng)髓方能顯著改善自發(fā)老年性癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，并明顯增高大腦皮質(zhì)錐體細胞的 RNA 和 Nissl 體含量，而且其作用呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)論：補肝養(yǎng)髓方改善自發(fā)老年性癡呆模型學(xué)習(xí)記憶障礙的機理可能與促進調(diào)節(jié)其大腦皮質(zhì)的 RNA 代謝，改善學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵腦區(qū)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  老年性癡呆；補肝養(yǎng)髓方；RNA；Nissl 體；大腦皮質(zhì)；小鼠   Abstract Objective  To  investigate  the  effec

3、ts  of  Bugan  Yangsui  formula  on  the  RNA  and  Nissl  Bodies of  cerebral  cortex  neuron  in  aged  dementia  mice.   Methods   Spontaneous  aged  dementia  mice  were&#

4、160; screened  out from  21  months  old  Kunming  mice  and  then  were  divided  randomly  into  4  groups,  namely  control,  westernmedicine,  lower  dosage  Bugan  Yangsui  formula 

5、; and  higher  dosage  Bugan  Yangsui  formula  group.  In addition, normal  aged  mice  group  was  also  set.  Brain  tissue  was  made  to  frozen  section.  Using  cytochemistry  me

6、thod  to show  RNA  and  Nissl  body,  and  using  automatic  micro-image  analysis  system  to  determine  quantitatively.  Results   Bugan  Yangsui  formula  could  improve  the  impa

7、irment  of  learning  and  memory  in  spontaneous  aged  dementia  mice,  and  it  could  significantly  improve  the  RNA  metabolism  of  cerebral  cortex  neurons  as  well  as

8、 enhance  the  content  of  Nissl  bodies  in  a  dose-dependent  manner.   Conclusion   Bugan  Yangsui  formula  could  remarkably  promote  the  RNA  metabolism  and  improve  th

9、e  structure  of  neurons  relevant  to  learning  and  memory  in  spontaneous  aged  dementia  mice.   Key  Words   Aaged  dementia;  Bugan  Yangsui  formula;  RNA;  Nissl 

10、body;  Cerebral  cortex;  Mouse   RNA 是細胞內(nèi)重要的生物大分子，通過指導(dǎo)和調(diào)控細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成調(diào)控著細胞的新陳代謝1，老年性癡呆患者 RNA 代謝異常；而 Nissl 體是神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)合成的場所，其數(shù)量與細胞代謝水平有關(guān)。因此，本研究觀察了補肝養(yǎng)髓方對老年性癡呆小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi) RNA 和 Nissl 體含量的影響。    1   材料與方法   1.1   自發(fā)老年性癡呆小鼠的篩選及分組給藥 

11、60; 雄性昆明種小鼠，13 月齡，購自中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)至 21 月齡，按國際通用標(biāo)準(zhǔn)和方法從老齡動物中篩選自發(fā)老年性癡呆學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠4-6。   將篩選出的老年性癡呆鼠 52 只隨機分為 4 組，分別為空白對照組、西藥對照組、補肝養(yǎng)髓小劑量組、補肝養(yǎng)髓大劑量組，每組 13 只，另以 13 只篩選出的老年學(xué)習(xí)記憶正常鼠作為正常對照組。西藥對照組給以 Hydergine 0.6 mg/kg，補肝養(yǎng)髓小、大劑量組分別予正交優(yōu)化的補肝養(yǎng)髓方 6.80 g/kg 及 20.41 g/kg，以上均研配成 0.5 mL 液體灌胃給藥，連續(xù) 60 d，正常對照組和老年性

12、癡呆組均灌以等量雙蒸水。   1.2   學(xué)習(xí)記憶功能檢測   給藥觀察第 59 天，灌胃 1 h 后進行跳臺訓(xùn)練，第 60 天給藥 1 h 后用 MR-921 型小鼠跳臺實驗自動記錄儀以跳臺試驗檢測學(xué)習(xí)和記憶成績。   1.3   相關(guān)腦區(qū) RNA 及 Nissl 體定性定量檢測   給藥觀察及學(xué)習(xí)記憶檢測結(jié)束后，每組隨機取小鼠 8 只，經(jīng) 1% 戊巴比妥納（40 mg/kg 體重，腹腔注射）麻醉下開胸，左心室主動脈插管結(jié)扎，生理鹽水 50 mL 沖洗，續(xù)以冷的多聚甲醛戊二

13、醛灌注固定液（含 4% 多聚甲醛、0.05% 戊二醛、0.1 mol/L 磷酸緩沖液 pH 7.27.4）灌注固定，取大腦于灌注液中后固定 2 h（4），然后入 20% 蔗糖緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）中 4 24 h。AO 冰凍切片機冠狀連續(xù)切片，片厚 30   m，切片收集于 0.1 mol/L PBS 中待用。   對照片用 Rnase 液（8 mg Rnase 溶于 10 mL 雙蒸水）37 消化 1 h 再入染液。   定量分析采用 LM ZEISS Axiotron 研究型顯微鏡、JVC KY-F30B3-C

14、CD Variocam 冷凍攝錄儀及Kontron IBAS 2.0 全自動圖像分析儀（Automatic Image Analysis System for Biomedical Application）。大腦皮質(zhì)測量區(qū)域選擇顳葉皮質(zhì)的第層即外錐體細胞層，海馬測量 CA 1 區(qū)錐體細胞，分別檢測單位面積內(nèi) RNA 及 Nissl 體細胞化學(xué)反應(yīng)物的光密度，以陽性反應(yīng)物的 A（OD）值減去背景 A 值得到校正的  A 值，即反應(yīng)產(chǎn)物的實際光密度。每例各指標(biāo)隨機抽取切片 3 張，每張切片于測定區(qū)域隨機測量 3 個視野，所有測量在同一光學(xué)條件下完成。   &

15、#160;        數(shù)據(jù)以 x±s 表示，采用 SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行方差分析和 q 檢驗。   2   實驗結(jié)果   2.1   補肝養(yǎng)髓不同劑量對自發(fā)老年性癡呆鼠學(xué)習(xí)記憶的影響   見表 1。   2.2   RNA 及 Nissl 體的定性定量觀察   RNA 陽性反應(yīng)物鏡下呈鮮艷紫紅色，對照片呈陰性，表明了該方法顯示 RNA 的特異性。老年正常

16、鼠大部分神經(jīng)元呈陽性反應(yīng)，皮質(zhì)錐體神經(jīng)元大多呈強陽性反應(yīng)，老年性癡呆鼠 RNA 陽性反應(yīng)明顯減弱，其余各組反應(yīng)強度介于老年正常鼠和老年性癡呆鼠之間。   鏡下可見神經(jīng)元內(nèi) Nissl 體染色呈紫蘭色，老年正常鼠皮質(zhì)錐體神經(jīng)元形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)清晰、Nissl 體含量豐富；癡呆鼠可見神經(jīng)元胞體皺縮、細胞變性、尼氏體明顯減少；其余各組介于老年正常鼠和老年性癡呆鼠之間。   顳葉皮質(zhì)外錐體層細胞 RNA 及 Nissl 體含量檢測結(jié)果見表 2、表 3。    3   討   論 

17、60; 我們以往的研究表明，補肝養(yǎng)髓方對東莨菪堿記憶獲得障礙、環(huán)已酰亞胺記憶鞏固障礙及乙醇所致記憶再現(xiàn)障礙病理模型均有顯著的拮抗效果，提示補肝養(yǎng)髓方對學(xué)習(xí)記憶過程的不同階段環(huán)節(jié)均有調(diào)節(jié)作用10。本實驗進一步觀察了補肝養(yǎng)髓方對自發(fā)老年性癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)能力的影響，結(jié)果顯示補肝養(yǎng)髓方能顯著提高其學(xué)習(xí)記憶成績，其藥效學(xué)作用還顯示出一定的量效相關(guān)關(guān)系。   細胞內(nèi)的 RNA 分 rRNA、tRNA 和 mRNA 三種，其中 rRNA 占 80% 以上，rRNA 與蛋白質(zhì)合成核糖體，作為蛋白質(zhì)合成的“工廠”，在 tRNA 的作用下，以 mRNA 為模板合成蛋白質(zhì)1。有關(guān)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)

18、生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大腦在學(xué)習(xí)記憶過程中，相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能隨著外界信息的整合而發(fā)生變化，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和 RNA 分子的含量也發(fā)生較大的變化。   Nissl 體是神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體聚集成簇的反映。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與蛋白質(zhì)的合成、糖基化、分選和運輸。神經(jīng)元內(nèi) Nissl 體含量愈豐富，表明其中蛋白質(zhì)代謝愈旺盛11。   促進和改善殘存的神經(jīng)元的細胞代謝是治療老年性癡呆的重要策略。本研究結(jié)果顯示，正常老年鼠神經(jīng)元尤其是皮質(zhì)錐體神經(jīng)元內(nèi) RNA 和 Nissl 體含量豐富，表明其細胞代謝旺盛；模型組 RNA 和Nissl 體含量顯著降低，表明其細胞

19、代謝低下。補肝養(yǎng)髓方能顯著提高老年性癡呆鼠顳葉皮質(zhì)錐體細胞RNA 及 Nissl 體的含量，表明該方能顯著改善老年性癡呆鼠核酸代謝和蛋白質(zhì)合成代謝，從而改善老年性癡呆的學(xué)習(xí)記憶障礙?！緟⒖嘉墨I】  1 賁長恩, 牛建昭. 分子細胞學(xué)與疾病M. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2003. 52-592 Nelson PT, Keller JN. RNA in brain disease: no longer just “the messenger in the middle”J. J Neuropathol Exp Neurol, 2007, 66(6):461-4683 史景泉, 陳意生, 卞修武. 超微病理學(xué)M. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005. 344 Gallagher M. Animal models of memory im