麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）生產(chǎn)工藝的建立

1、    【摘要】  目的  研制麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）。方法  用麻疹病毒長-47株接種人二倍體細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，收獲病毒液并加適量穩(wěn)定劑后凍干制成疫苗。疫苗按2005年版中國藥典三部進(jìn)行檢定。結(jié)果  麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合2005年版中國藥典三部的要求。結(jié)論  人二倍體細(xì)胞為基質(zhì)可以制備麻疹減毒活疫苗，疫苗質(zhì)量穩(wěn)定，收獲率較高。    【關(guān)鍵詞】  麻疹減毒活疫苗；人二倍體細(xì)胞；收獲率

2、        麻疹是由麻疹病毒引起的主要罹及嬰幼兒急性傳染病。在我國麻疹減毒活疫苗應(yīng)用已有近40年的歷史，制備疫苗均以雞胚細(xì)胞為基質(zhì)，作為異源細(xì)胞，具有攜帶禽病毒的可能，而人二倍體細(xì)胞為人源細(xì)胞1，在國外早已用來生產(chǎn)麻疹減毒活疫苗。人二倍體細(xì)胞（2BS株）現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)，如甲肝減毒活疫苗、水痘減毒活疫苗等，已證明其具有安全性。我們用人二倍體細(xì)胞為基質(zhì)制備出符合2005年版中國藥典三部要求的麻疹減毒活疫苗，本文就此做如下報(bào)告。1  材料1.1  細(xì)胞  生產(chǎn)用細(xì)胞為人二倍體細(xì)胞2BS株，

3、用于生產(chǎn)的細(xì)胞世代限定在43代以內(nèi)。1.2  毒種  雞胚細(xì)胞為培養(yǎng)基質(zhì)制備的麻疹減毒活疫苗毒種長47株27代適應(yīng)于人二倍體細(xì)胞，33和35培養(yǎng)，收獲制成，經(jīng)檢定后用于生產(chǎn)，并已有多個(gè)代次毒種制備疫苗，證明此毒種具有良好的傳代穩(wěn)定性。1.3  培養(yǎng)液及維持液  MEM為基礎(chǔ)液，加入適當(dāng)比例的滅能小牛血清，碳酸氫鈉調(diào)pH值。1.4  疫苗液  199液，pH值為7.47.5。2  方法2.1  單層法制備麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）&#

4、160; 單層人二倍體細(xì)胞2BS株按1：21：4傳代，接種2L克氏瓶，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，180ml/瓶，置37培養(yǎng)。當(dāng)人二倍體細(xì)胞長成單層時(shí)，換成細(xì)胞維持液，200ml/瓶，再加入毒種，毒種的感染劑量（MOI）為1：100。將感染病毒的細(xì)胞瓶置35培養(yǎng)，此方法稱為單層法。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)50%以上時(shí)，用400ml Earles液沖洗細(xì)胞面，去除小牛血清，加入疫苗液，200500ml/瓶，置35培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)90%以上時(shí)，收到4冷庫。在4冷庫釋放病毒1周，按0.3%加入人血白蛋白作保護(hù)劑，抽樣檢定。檢定合格后，加入蔗糖明膠穩(wěn)定劑及長8號(hào)微量保護(hù)劑，采用適宜的凍干曲線凍干。2.2 

5、; 同時(shí)法制備麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）  單層人二倍體細(xì)胞2BS株按1：2傳代，毒種的感染劑量（MOI）為1：1000。將細(xì)胞、病毒和培養(yǎng)液同時(shí)分裝到10L瓶中（即同時(shí)法），2000ml/瓶，置35旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速為78r/h。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)50%以上時(shí)，用3000ml Earles液沖洗細(xì)胞面，去除小牛血清，加入疫苗液，20005000ml/瓶，置35旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)90%以上時(shí)，收冷到4冷庫轉(zhuǎn)瓶機(jī)上。在4冷庫釋放病毒1周，按0.3%加入人血白蛋白作保護(hù)劑，抽樣檢定。檢定合格后，加入蔗糖明膠穩(wěn)定劑及長8號(hào)微量保護(hù)劑，采用適宜的凍干曲線凍干。2.3&

6、#160; 無菌試驗(yàn)、鑒別試驗(yàn)、異常毒性試驗(yàn)、水分、物理檢查  按2005年版中國藥典三部進(jìn)行常規(guī)檢定2。2.4  牛血清白蛋白殘留量檢測(cè)  采用放射免疫法。應(yīng)不高于50ng/劑。2.5  病毒滴度及熱穩(wěn)定性試驗(yàn)（37 7d）  采用微量細(xì)胞病變法。成品病毒滴度及37放置7天前后均不低于3.3 LgCCID50/ml，37放置7天后病毒滴度下降不得超過1.0 Lg。 3  結(jié)果3.1  麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）成品檢定3.1.1 

7、 不同培養(yǎng)方法制備的麻疹減毒活疫苗基礎(chǔ)滴度及熱穩(wěn)定性的比較  單層法與同時(shí)法制備麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）的病毒滴度及熱穩(wěn)定性均達(dá)到2005年版中國藥典三部的要求，見表1。表1  單層法與同時(shí)法制備麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）的病毒滴度及熱穩(wěn)定性（略）    經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，t值分別為1.51、1.49，P均0.05，差異無顯著性，因此，單層法與同時(shí)法制備麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）的病毒滴度及熱穩(wěn)定性無區(qū)別，兩種方法均可以用于疫苗生產(chǎn)。3.1.2  不同代次毒種制備的麻疹減毒活疫苗(人二倍體細(xì)胞)

8、基礎(chǔ)滴度及熱穩(wěn)定性  分別以不同代次的毒種制備麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞），其基礎(chǔ)滴度及熱穩(wěn)定性均符合2005年版中國藥典三部的要求，結(jié)果見表2。表2  不同代次毒種制備的麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）基礎(chǔ)滴度及熱穩(wěn)定性（略）     9代、10代、11代毒種制備出的疫苗基礎(chǔ)滴度及37穩(wěn)定性均達(dá)到2005年版中國藥典三部的要求，因此不同代次的毒種均可以制備疫苗。3.1.3  不同培養(yǎng)方法制備的麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)胞）牛血清白蛋白殘留量檢測(cè)  單層法與同時(shí)法制備的麻疹減毒活疫苗（人二倍體細(xì)