現(xiàn)代生化技術(shù)練習(xí)題——匯總復(fù)習(xí)提綱

1、第一章生命大分子物質(zhì)的制備習(xí)題1、作為現(xiàn)代生化制備的主要對象的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子有何特點？（1）成分復(fù)雜：生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。有的生物大分子在分離過程中還在不斷的代謝，所以生物大分子的分離純化方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離制備的標準方法是不可能的。（2）含量甚微：許多生物大分子在生物材料中的含量極微，只有萬分之一、幾十萬分之一，甚至幾百萬分之一。分離純化的步驟繁多，流程又長，有的目的產(chǎn)物要經(jīng)過十幾步、幾十步的操作才能達到所需純度的要求。（3）易變性易被破壞：許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失

2、活，就是生物大分子提取制備最困難之處。過酸、過堿、高溫、劇烈的攪拌、強輻射及本身的自溶等都會使生物大分子變性而失活，所以分離純化時一定要選用最適宜的環(huán)境和條件。（4）具經(jīng)驗性：生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響，很難準確估計和判斷，因而實驗結(jié)果常有很大的經(jīng)驗成份，實驗的重復(fù)性較差，個人的實驗技術(shù)水平和經(jīng)驗對實驗結(jié)果會有較大的影響。（5）均一性的相對性：生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，通常只采用一種方法是不夠的，必須同時采用23種不同的純度鑒定法才能確定。2、生物物質(zhì)制備方案的設(shè)計基本原則是什么？生物物質(zhì)的制備一般包括初始

3、階段、中間階段和精制階段。在制備方法的選擇上，初始階段宜選擇粗放、分辨率低、快速、有利于縮小樣品體積和減少后工序的方法，主要考慮樣品量和處理速度兩個指標；中間階段選擇的方法應(yīng)在考慮樣品處理量的基礎(chǔ)上適當(dāng)提高分辨率。精制階段宜選擇精確、分辨率高、需樣品少的方法。在安排各種分離純化方法的使用程序時應(yīng)注意：（1）不適宜連續(xù)使用同一種分離純化方法，應(yīng)該交叉使用，因為每一步分離后，性質(zhì)相似的物質(zhì)聚在一塊；（2）使用順序還要考慮到有利于減少工序、提高效率。3、綜合評價生物物質(zhì)制備步驟方法的好壞應(yīng)從哪些方面進行？每一個制備步驟方法的好壞，除了從分辨本領(lǐng)和重現(xiàn)性二方面考慮外，還注意方法本身的回收率和純化倍數(shù)，

4、特別是制備某些含量很少的物質(zhì)時，回收率的高低十分重要。因此綜合評價試驗方案的優(yōu)劣應(yīng)從分辨本領(lǐng)、重現(xiàn)性、回收率和純化倍數(shù)等方面進行。一個好的制備方法應(yīng)該使純化倍數(shù)和收得率都同時有較大提高。但在實際過程中，隨純化倍數(shù)的提高，收得率是逐漸降低的。因此應(yīng)該根據(jù)材料的來源難易（難收得率優(yōu)先考慮，易純化倍數(shù)優(yōu)先考慮）和制備物的目的等方面來綜合評定方法的優(yōu)劣。4、利用下表中的方案制備長春花Strictosidine合成酶，現(xiàn)已測得各步驟總蛋白和總活力結(jié)果，試完成下表。步驟總蛋白（mg）總活力（nKat）比活力（nKat/mg）產(chǎn)率（%）提純倍數(shù)（1）粗抽提液（2）硫酸銨沉淀（3）DEAD纖維素柱層析（4）羥

5、基磷灰石柱層析（5）Sephadex G-75凝膠柱層析（6）等點聚焦65446638.75.90.720.085.25.13.93.82.00.55、提取生物活性物質(zhì)時，活性保護性措施有哪些？提取一些具有生理活性的物質(zhì)時，除了考慮被提取物溶解度外，還應(yīng)考慮被提取物活性的保護。對于一些生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸來說，主要措施有如下幾點：（1）采用緩沖系統(tǒng)；（2）加入保護劑；（3）抑制水解酶的破壞；（4）其它一些特殊要求的保護措施。6、蛋白質(zhì)、DNA和RNA的常用提取方法有哪些？（1）蛋白質(zhì)和酶的提取方法：水溶液提取、有機溶劑提?。?）DNA的提取方法：濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚抽提法、水抽

6、提法（3）RNA的提取方法：苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。7、提取組織中的胰島素時，為什么采用68乙醇溶液（用草酸調(diào)溶液的pH為2.53.0）為溶劑進行提取。胰島素可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但在組織中與其共存的糜蛋白酶對胰島素有極高的水解活性，采用68乙醇溶液（用草酸調(diào)溶液的pH為2.53.0）進行提取，可以從下面三個方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：68的乙醇可以使糜蛋白酶暫時失活；草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca+；選用pH2.53.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。第二章常用生物化學(xué)檢驗技術(shù)習(xí)題1、蛋白質(zhì)的化學(xué)物理檢測方法主要有哪些？各方法的基本原理是什么？紫外吸收法：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等

7、氨基酸在280nm波長左右具有紫外吸收，且吸光度與其濃度成線性，根據(jù)此性質(zhì)可用于蛋白質(zhì)的定量測定。凱氏定氮法：該法根據(jù)一般蛋白質(zhì)含氮量為16%的特點，將樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲法：雙縮脲在堿性溶液中與Cu2+結(jié)合生成紫色絡(luò)合物，這一呈色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵類似雙縮脲結(jié)構(gòu)，故亦能呈雙縮脲反應(yīng)。在一定的濃度范圍內(nèi)，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。蛋白質(zhì)濃度越高，體系的顏色

8、越深。反應(yīng)產(chǎn)物在540nm處有最大光吸收。 福林酚試劑法：Folin-酚試劑由試劑A和試劑B兩部分組成。在Folin-酚試劑法中，蛋白質(zhì)中的肽鍵首先在堿性條件下與酒石酸鉀鈉-銅鹽溶液（試劑A）起作用生成紫色絡(luò)合物（類似雙縮脲反應(yīng)）。由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸的存在，該絡(luò)合物在堿性條件下進而與試劑B（磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成）形成藍色復(fù)合物，其呈色反應(yīng)顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比?？捡R斯亮藍法：考馬斯亮藍G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色?？捡R斯亮藍G-250在酸性游離狀態(tài)下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)樗{色，最大光吸收在595nm。2、糖類的化學(xué)檢測方

9、法主要有哪些？蘭愛農(nóng)（Lane-Eynon）法、斐林試劑快速法（GB法）、碘量法、銅試劑法、高錳酸鉀法3、核酸的化學(xué)檢測方法主要有哪些？定磷法、二苯胺法和地衣酚法4、凱氏定氮法的基本原理是什么？其主要操作步驟包括哪些？該法中加入硫酸鉀和硫酸銅的作用是什么？原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。主要操作步驟：消化、蒸餾、滴定加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加快有機物的分解，硫酸銅主要作為催化劑，同時可以

10、指示消化終點的到達。5、放射自顯影技術(shù)的基本原理是什么？其原理是將放射性同位素（如14C和3H）標記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標本中標記物的準確位置和數(shù)量。6. 生物檢測內(nèi)容主要有哪些？安全性檢測包括哪些內(nèi)容？生物檢測內(nèi)容主要包括生物效價測定和安全性試驗。安全性檢測主要包括毒性試驗、局部刺激性試驗、溶血實驗、熱原試驗、過敏試驗和變異原試驗。7. 蘭-愛農(nóng)法測定糖類的基本原理是什么？蘭-愛農(nóng)法是指以次甲基藍作為指示劑，直接將還原糖滴定到斐林試

11、劑中進行測定的方法。斐林試劑中的酒石酸鉀鈉銅氧化還原糖分子中的游離羰基，本身被還原氧化亞銅紅色沉淀。由于次甲基藍氧化能力比二價銅弱，待二價銅全部還原后，過量1滴還原糖使次甲基藍還原，藍色消失而達滴定終點。第三章電泳技術(shù)習(xí)題1、什么是電滲現(xiàn)象？其對電泳過程有何影響液體在電場中，由于支持介質(zhì)表面可能會存在一些帶電基團，吸附一些帶相反電荷的離子，在電場的作用下向電極方向移動，形成介質(zhì)表面溶液的流動，這種現(xiàn)象就是電滲。如果電滲方向與電泳方向相同，則加快電泳速度；如果電滲方向與電泳方向相反，則降低電泳速度。2、現(xiàn)有電泳技術(shù)按照原理及支持介質(zhì)的不同，分為哪幾類？按原理不同可分為：移動界面電泳、區(qū)帶電泳、等

12、電聚焦電泳和等速電泳按支持介質(zhì)形狀不同可它為：薄層電泳、板電泳和柱電泳。3、蛋白質(zhì)在不連續(xù)PAGE中實現(xiàn)分離的基本原理是什么？不連續(xù)PAGE電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果比連續(xù)系統(tǒng)更好。（1）樣品濃縮效應(yīng)：凝膠孔徑的不連續(xù)性：濃縮膠為大孔膠，分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當(dāng)進入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性： HCl在任何pH溶液中均易解離出(Cl

13、-)，在電場中遷移率快，走在最前面稱為快離子。在電極緩沖液中，除有Tris 外，還有甘氨酸(glycine)，其pI=6.0，在pH8.3的電極緩沖液中，易解離出甘氨酸根(NH2 CH2COO-)，而在pH6.7的凝膠緩沖體系中，甘氨酸解離度僅有0.1%-1%，因而在電場中遷移很慢，稱為慢離子。當(dāng)進入pH8.9的分離膠時，甘氨酸解離度增加。電位梯度的不連續(xù)性：電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低的低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的區(qū)帶。（2）分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。（3）

14、電荷效應(yīng)：在pH8.9的分離膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質(zhì)有不同的遷移率。凈電荷多，則遷移快；反之，則慢。因此，各種蛋白質(zhì)按電荷多少、相對分子質(zhì)量及形狀，以一定順序排成一個個區(qū)帶，因而稱為區(qū)帶電泳。4、SDS-PAGE測定蛋白分子量的原理是什么？由于SDS帶有大量負電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負電荷，因而主要利用蛋白分子量的差異而將各種蛋白質(zhì)分開，因此根據(jù)未知蛋白和標準系列蛋白的移動距離可測定出未知蛋白的分子量。5、蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳和DNA瓊脂糖凝膠電泳中，凝膠濃度與被分

15、離分子的大小有何關(guān)系？聚丙烯酰胺凝膠濃度越大，允許通過的蛋白分子越小；瓊脂糖凝膠濃度越大，允許通過的DNA片段短。6、某同學(xué)在進行SDS-PAGE時，發(fā)現(xiàn)電壓很高而電流卻很低，試分析其原因，并提出處理措施。這種現(xiàn)象主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。處理辦法：電泳槽正確裝配即可。7、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液中一般需要加入適量的EDTA，其目的是什么？目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。8、瓊脂糖凝膠電泳的電泳緩沖液常用的有哪些？各有何特點？&

16、#160;    TAE是使用最廣泛的緩沖系統(tǒng)。其特點是超螺旋在其中電泳時更符合實際相對分子質(zhì)量（TBE中電泳時測出的相對分子質(zhì)量會大于實際分子質(zhì)量），且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較其他兩種緩沖液快約10%，電泳大于13kb的片段時用TAE緩沖液將取得更好的分離效果，此外，回收DNA片段時也宜用TAE緩沖系統(tǒng)進行電泳。TAE的缺點是緩沖容量小，長時間電泳（如過夜）不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。      TBE的特點是緩沖能力強，長時間電泳時可選用TBE，并且當(dāng)用于電泳小于1kb的片段

17、時分離效果更好。TBE用于瓊脂糖凝膠時易造成高電滲作用，并且因與瓊脂糖相互作用生成非共價結(jié)合的四羥基硼酸鹽復(fù)合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收電泳中使用。       TPE的緩沖能力也較強，但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的電泳中使用。9、溫度梯度凝膠電泳測定DNA點突變的原理是什么？一個特定的 DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域和解鏈行為。一個幾百個堿基對的 DNA 片段一般有幾個解鏈區(qū)域，每個解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對組成。當(dāng)溫度逐漸升高達到其最低的解鏈區(qū)域溫度時

18、，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對發(fā)生解鏈。當(dāng)溫度再升高依次達到各其他解鏈區(qū)域溫度時，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到溫度達到最高的解鏈區(qū)域溫度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而雙鏈 DNA 完全解鏈。不同的雙鏈 DNA 片段因為其序列組成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當(dāng)它們進行 DGGE/TGGE 時，一開始溫度（或變性劑濃度）比較小，不能使雙鏈 DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。然而一旦 DNA 片段遷移到一特定位置，其溫度（或變性劑濃度）剛好能使雙鏈 DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈時，雙鏈 DNA 片段最低的解鏈區(qū)域

19、立即發(fā)生解鏈。部分解鏈的 DNA 片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，同樣長度但序列不同的 DNA 片段會在膠中不同位置處達到各自最低解鏈區(qū)域的解鏈溫度，因此它們會在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來。如果不同 DNA 片段的序列差異發(fā)生在最高的解鏈區(qū)域時，可在 DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段以防止 DNA 片段在膠中完全解鏈。當(dāng)加了 GC 夾子后，DNA 片段中基本上每個堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。10、什么是IEF-PAGE？以PAG為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrier amphol ytes)，在電場作用

20、下，兩性電解質(zhì)載體在凝膠中移動，形成pH梯度，蛋白質(zhì)在凝膠中遷移 至其pI的pH處，即不再泳動而聚焦成帶，這種方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(isoelectric focusing-PAGE,簡釋IEF-PAGE)。11、試通過與高效液相色譜、普通電泳方法的比較，說明毛細管電泳的特點。CE和高效液相色譜法(HPLC)相比, 其相同處在于都是高效分離技術(shù), 儀器操作均可自動化, 且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時間取代HPLC中的保留時間, CE的分析時間通常不超過30min, 比HPLC速度快；對CE而言, 從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴散系數(shù)成正比, 對擴散系

21、數(shù)小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需樣品為nl級, 最低可達270fl, 流動相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為l級, 流動相則需幾百毫升乃至更多；但CE僅能實現(xiàn)微量制備, 而HPLC可作常量制備。CE和普通電泳相比, 由于其采用高電場, 因此分離速度要快得多；檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外, 其它類型檢測器均已和CE實現(xiàn)了連接檢測；一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自動化程度比普通電泳要高得多。12、綜合題：請結(jié)合本課程與生物化學(xué)課程知識，對蛋白質(zhì)分子量測定方法、含量測定方法、等電點測定方法、純度鑒定方法作一小結(jié)。（略）第四章生物

22、傳感器習(xí)題1、什么是生物傳感器？生物傳感器是由固定化的具有分子識別功能的生物材料、換能器和信號處理放大裝置組成的分析工具或系統(tǒng)。2、生物傳感器的基本組成如何？其作用是什么？生物傳感器主要由三部分構(gòu)成：（1）生物識別元件：是酶、抗原(體)、細胞器、組織切片和微生物細胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對被測定的物質(zhì)有選擇性的分子識別能力。（2）換能器：能將識別元件上進行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號的裝置，在一定條件下，產(chǎn)生的電信號強度和反應(yīng)中物質(zhì)的變化量或光、熱等的強度呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。（3）信號處理放大裝置：主要負責(zé)信號的分析處理和放大輸出。3、微生物傳

23、感器分為哪些類型？分為兩類：好氣性微生物傳感器、厭氣性微生物傳感器4、生物傳感器的固定方法有哪些？主要有夾心法、吸附法、包埋法、共價連接法、交聯(lián)法、微膠囊法等。5、論述題：論述生物傳感器在發(fā)酵工業(yè)、食品、生物工程、醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域中的應(yīng)用略6、論述題：談?wù)勀銓ι飩鞲衅鹘窈蟀l(fā)展趨勢的認識。略第五章生物芯片習(xí)題1、什么是生物芯片？生物芯片又稱為生物微陣列（Bio- micro array), 是將大量的DNA、寡核苷酸探針、多肽或蛋白質(zhì)密集排列在固相介質(zhì)上，實現(xiàn)生物信息的大規(guī)模檢測。2、何謂基因芯片？基因芯片系指將大量核酸探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子

24、的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。3、基因芯片的工作原理是什么？基因芯片的工作原理主要包括三方面：錨定：將大量已知基因片段以微陣列方式固定在支持物上，其密度很高捕獲：待測樣品用熒光染料標記制成探針，當(dāng)探針與芯片上的靶基因雜交而被捕獲。識別：經(jīng)嚴格洗滌，除去未雜交或部分配對的探針DNA分子，用熒光檢測儀定量分析雜交信號強度，由于探針與靶基因完全配對的產(chǎn)生的熒光信號強度比含一個或兩個錯配堿基的雜合分子高數(shù)十倍，因而精確測定信號即可實現(xiàn)檢測的特異性。4、基因芯片的制作方法有哪些？主要有原位合成法和合成點樣法兩種。5、什么是蛋白質(zhì)芯片？蛋白質(zhì)芯片, 又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋

25、白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標記了熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。6、蛋白質(zhì)芯片的制作方法有哪些？制備蛋白質(zhì)芯片的方法主要有3種：共價鍵結(jié)合法、凝膠墊結(jié)合法和吸附固定法。7、論述題：根據(jù)你的理解，談?wù)劵蛐酒虻鞍踪|(zhì)芯片在社會領(lǐng)域的應(yīng)用。略第六章DNA序列測定習(xí)題1、DNA測序的方法有哪些？經(jīng)典的方法主要有Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert DNA化學(xué)降解法；較新的方法有：雜交測序法、質(zhì)譜法、單分子測序法、原子探針顯微鏡測序法、

26、流式細胞儀測序法、PCR法和DNA 芯片法。2、Sanger雙脫氧鏈終止法測定DNA序列的原理是什么？DNA的合成總是從5端向3端進行的。DNA的合成需要模板以及相應(yīng)的引物鏈。DNA的合成過程中，在合成的DNA鏈的3末端，依據(jù)堿基配對的原則，通過生成新的3，5磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成終止，產(chǎn)生短的DNA鏈。具體測序工作中，平行進行四組反應(yīng)，每組反應(yīng)均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸；并在四組反應(yīng)中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機地接入DNA鏈中，因為缺少一個形成磷酸二酯鍵所必需的3'-OH而使DNA鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的DNA鏈。

27、這四組DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測DNA的核苷酸序列。3、Sanger雙脫氧鏈終止法測定DNA序列需要哪些構(gòu)件元素？質(zhì)粒載體系統(tǒng)、引物、DNA模板、DNA聚合酶、放射性標記dNTP、dNTP類似物（如ddNTP）4、采用Sanger雙脫氧鏈終止法測定某DNA序列時，電泳譜圖如下圖所示，請寫出該DNA序列。AGTCCGTAGATT5、化學(xué)降解法測定DNA序列的原理是什么？化學(xué)裂解法的原理是用化學(xué)試劑在A、G、C、T處特定地裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE和放射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。常用的化學(xué)試劑及其

28、斷裂的堿基位置主要有：（1）硫酸二甲酯使鳥嘌呤G甲基化，再加哌啶在加熱的條件下使G脫落；（2）硫酸二甲酯使鳥嘌呤G甲基化，加甲酸使AG完全分開，再加哌啶使A脫落；（3）用肼和哌啶使T和C斷裂；（4）用2mol/L氯化鈉加肼，只斷裂C。6、化學(xué)降解法測定DNA序列的基本步驟是什么？（1）將DNA的末端之一進行標記(通常為放射性同位素32P；（2）在多組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別進行特定堿基的化學(xué)修飾；（3）在修飾堿基位置化學(xué)法斷開DNA鏈；（4）采用聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開，根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，讀出DNA的核苷酸序列。7、采用化學(xué)降解法測定某DNA序列時，電泳譜圖如下圖所示，請寫

29、出該DNA序列。AGTCCGTAGATT第七章標記習(xí)題1、何為標記？常用的標記物有哪些？標記是指以共價鍵方式將放射性元素或非放射性物質(zhì)結(jié)合到某些生命物質(zhì)上的過程。常用的標記物主要包括放射性物質(zhì)和非放射性物質(zhì)，放射性標記元素如3H、14C、32P、35S、125I等；非放射性物質(zhì)如地高辛、生物素、酶、熒光素等。2、雙鏈DNA探針標記的方法有哪些？隨機引物引導(dǎo)法切口平移法3、列舉一種核酸標記的新方法，并說明其特點。掃若侖標記：掃若侖（psoralen）是一種天然的三環(huán)化合物，其帶有胺活性基團衍生物可用來標記多種核酸（如DNA、RNA、PCR產(chǎn)物和寡核苷酸等）。用其制成的探針靈敏度高（可達fg級別）

30、。掃若侖標記為非酶促反應(yīng)，是用波長320400nm的紫外光照射，引起光循環(huán)反應(yīng)，使帶胺基的掃若侖以三環(huán)平面形式插入核酸分子，并以共價鍵結(jié)合形成探針，DNA和RNA時，共價鍵結(jié)合的位置分別在dT和U處；探針中掃若侖衍生物的含量與核酸中胸苷（ dT ）或尿苷（U）的含量成正比關(guān)系。分子燈塔探針：一種新的非核素化合物標記，用于檢測特別序列核酸的核酸探針。標記化合物類似燈塔，由25個核苷酸組成，燈中間環(huán)形的15個核苷酸與靶DNA是互補序列，燈竿一端的5個核苷酸與另一端的5個核苷酸是互補，在5 和3端分別耦合一種熒光素（發(fā)光劑）和非熒光素（熄滅劑）。分子燈塔探針的熄滅劑可吸收發(fā)光劑發(fā)射的能量。在室溫條件

31、下，分子燈塔的構(gòu)型可確保發(fā)光劑和熄滅劑緊密互補結(jié)合，致使熒光基團處于熄滅狀態(tài)，無熒光產(chǎn)生；一旦當(dāng)燈塔探針的15個核苷酸與靶DNA或RNA序列雜交時，其發(fā)光劑和熄滅劑便相互分離，產(chǎn)生熒光。4、說明蛋白質(zhì)金標記方法的原理、種類和用途。原理：借助金粒的電子密度特征，用其與抗體偶聯(lián)后，可成功地置顯微鏡下觀察膠體金顆粒。分類：根據(jù)金粒子大小，一般分為5 nm、l0 nm和20 nm三種。用途：5nm粒子容易滲透到細胞膜，使細胞間染色，適用于電子顯微鏡準確定位抗原。l0nm粒子較大，可使細胞表面染色，適用于光學(xué)顯微鏡觀察。20nm粒子可用于免疫印跡和某些細胞和組織化學(xué)免疫染色。第八、九章氣液相色譜法習(xí)題1

32、、什么是色譜法？是利用混合物不同組分在固定相和流動相中分配系數(shù)(或吸附系數(shù)、滲透性等)的差異，使不同組分在作相對運動的兩相中進行反復(fù)分配，實現(xiàn)分離的分析方法。2、色譜法按流動相物理狀態(tài)和分離原理可分為哪些類型？按流動相物理狀態(tài)可分為氣相色譜、液相色譜和超臨界流體色譜。按分離原理可分為吸附色譜、分配色譜、離子色譜和凝膠色譜。3、色譜峰的區(qū)域?qū)挾韧ǔ？捎媚男﹨?shù)表示？標準偏差s、半峰寬、峰底寬度。4、什么是保留時間？什么是保留體積？色譜分析中，試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間，稱為保留時間。色譜分析中，試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所流過的流動相體積，稱為保留體積。5、根據(jù)色譜流出曲線可獲得