生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)自編教材1

1、生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院劉杰鳳 王 穎 馬 超 董宏坡 尹愛(ài)國(guó)合編2010年8月引 言隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物工程的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員的需求更為迫切，特別是生物技術(shù)已經(jīng)滲透到各個(gè)行業(yè)，并已蓬勃發(fā)展。生物技術(shù)的發(fā)展不但要有深厚的理論基礎(chǔ)，而且要求專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員具有較強(qiáng)的動(dòng)手能力，因?yàn)樵搶W(xué)科是一門(mén)實(shí)踐性較強(qiáng)的科學(xué)。在培養(yǎng)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)學(xué)生時(shí)要特別注意學(xué)生實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ呐囵B(yǎng)，尤其是專(zhuān)業(yè)基本操作。本專(zhuān)業(yè)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)課程已經(jīng)包括生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、微生物實(shí)驗(yàn)、基因工程實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)等課程實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)為培養(yǎng)學(xué)生的基礎(chǔ)操作能力、提高學(xué)生的實(shí)際動(dòng)手能力等奠定了良好的基礎(chǔ)，但是這些實(shí)

2、驗(yàn)都是單個(gè)的小實(shí)驗(yàn)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)各自為一體，沒(méi)有系統(tǒng)地相互關(guān)聯(lián)，學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)后沒(méi)有一個(gè)完整的概念。本實(shí)驗(yàn)以基因工程、細(xì)胞工程和發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，組成了生物工程中上游、中游和下游技術(shù)。其中每一個(gè)部分放棄了原來(lái)單獨(dú)小實(shí)驗(yàn)的結(jié)構(gòu)，而改為一個(gè)獨(dú)立的大實(shí)驗(yàn)，增加了學(xué)生的設(shè)計(jì)性和主動(dòng)性。這些實(shí)驗(yàn)既注重和加強(qiáng)了原來(lái)各自的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，又注意到相互聯(lián)系。本講義分為三個(gè)部分，第一部分“DNA重組技術(shù)與基因檢測(cè)芯片技術(shù)”；第二部分“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù)”；第三部分“發(fā)酵工程及分離提取技術(shù)”。這些實(shí)驗(yàn)采取大實(shí)驗(yàn)方法，使學(xué)生有一個(gè)完整的操作過(guò)程，對(duì)理解生物工程的上游、中游和下游技術(shù)有了感性認(rèn)識(shí)。目錄第一部分分子生

3、物學(xué)與基因工程實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒的制備1實(shí)驗(yàn)二 DNA的瓊脂糖凝膠電泳2實(shí)驗(yàn)三外源DNA片段在質(zhì)粒載體中的克隆3實(shí)驗(yàn)四感受態(tài)細(xì)胞的制備5實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定7（一）、熱激法轉(zhuǎn)化7（二）、電轉(zhuǎn)化法7實(shí)驗(yàn)六植物總DNA的快速少量抽提9（一）、SDS提取法9（二）、CTAB提取法10實(shí)驗(yàn)七總DNA質(zhì)量檢測(cè)及酶切10實(shí)驗(yàn)八 PCR技術(shù)11第二部分蛋白質(zhì)的分離、純化13動(dòng)物肝臟過(guò)氧化氫酶的提取分離純化13動(dòng)物血中超氧化物歧化酶的提取與純化15實(shí)驗(yàn)一紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量20實(shí)驗(yàn)二考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量22實(shí)驗(yàn)三過(guò)氧化氫酶活力的測(cè)定24實(shí)驗(yàn)四離子交換柱層析法分離純化蛋白質(zhì)2

4、6實(shí)驗(yàn)五 SDS-PAGE電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量29附錄33附錄一試劑配方33附錄二硫酸銨飽和度常用表36附錄三常用緩沖溶液的配制38參考文獻(xiàn)39第一部分分子生物學(xué)與基因工程實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的制備質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過(guò)程。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。二、實(shí)驗(yàn)材料含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿

5、菌菌液。三、實(shí)驗(yàn)原理在pH 12.0 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37過(guò)夜培養(yǎng)；2. 用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37搖床250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)

6、；3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；4. 加入300l溶液 I振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊）；5. 加入300l溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過(guò)5min；6. 加入300l溶液III顛倒混勻，放置于冰上10min，使雜質(zhì)充分沉淀；7. 12000 g離心10分鐘；8. 吸取800 l上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5min；9. 12000 g常溫離心15min；10. 倒盡上清，加75乙

7、醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3min后倒去上清）；11. 室溫放置或超凈臺(tái)上風(fēng)干DNA；12. 加40l滅菌超純水或TE溶解；13. 質(zhì)粒、BAC的質(zhì)量檢測(cè)，于-20保存。五、備注質(zhì)粒檢測(cè)：電泳檢測(cè)：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線型三種構(gòu)型。吸光值檢測(cè)：采用分光光度計(jì)檢測(cè)260nm、280nm波長(zhǎng)吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.71.9之間，說(shuō)明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為最佳，低于1.8說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說(shuō)明有RNA污染。實(shí)驗(yàn)二 DNA的瓊脂糖凝膠電泳帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱(chēng)為電泳。電泳的種類(lèi)多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物

8、大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳的原理，學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。二、實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒DNA、BAC、植物總DNA或它們的酶切產(chǎn)物。三、實(shí)驗(yàn)原理在pH值為8.08.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。四、實(shí)驗(yàn)步驟1用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的

9、兩端封好，水平放置在工作臺(tái)上；2調(diào)整好梳子的高度；3稱(chēng)取0.24 g瓊脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至45-50ºC時(shí)倒入制膠板中；4凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；5將電泳樣品與溴酚藍(lán)混合后將樣品依次點(diǎn)入加樣孔中；pUC18 5l + ddH2O 3l + 溴酚藍(lán)2l 共10l于0.5ml tube中混合后點(diǎn)樣；6將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開(kāi)電泳儀，使核酸樣品向正極泳動(dòng)；7電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5g/ml的溴化乙錠（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。

10、五、附注1影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：(1) DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）(2) 瓊脂糖濃度：logU=logU0 Kr膠濃度，U為遷移率，U0為DNA的自由電泳遷移率，為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose：0.5%： 1-30 kb；0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb；1.5%： 0.2-3 kb.(3) DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA&g

11、t;單鏈開(kāi)環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。(4) 所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過(guò)5V/cm(5) 堿基組成與溫度：一般影響不大4 -30 (6) 嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)(7) 電泳緩沖液（0.5×TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率，無(wú)離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過(guò)大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。2溴化乙錠（

12、EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。3電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（Bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（Xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。實(shí)驗(yàn)三外源DNA片段在質(zhì)粒載體中的克隆DNA重組技術(shù)包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內(nèi)容。DNA片段的克隆技術(shù)是分子操作的核心部分。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將BAC克隆所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到pUC18載體上。二、實(shí)

13、驗(yàn)材料外源片段來(lái)自一個(gè)含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆載體為PUC18。三、實(shí)驗(yàn)原理限制性內(nèi)切酶可識(shí)別特定位點(diǎn)并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應(yīng)；選擇克隆載體pUC18多克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆。四、實(shí)驗(yàn)步驟1載體pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：（50 l反應(yīng)體系，用1.5ml tube，冰上操作）：DNA 30lR.E 1l10×buffer 5lddH2O14l37反應(yīng)1hr，分別取8l外源片段酶切產(chǎn)物和5l PUC18

14、酶切產(chǎn)物于1.0%凝膠檢測(cè)酶切是否完全；按25步純化、回收DNA2加入ddH2O 150l（擴(kuò)大體積），加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000g離心10 min；3吸取上清，加1/10體積3M NaAc和兩倍體積無(wú)水乙醇，-20放置15分鐘以上；412000g4冷凍離心15分鐘；5倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后外源DNA溶于10l ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20l ddH2O（1.5ml tube中）；6按以下反應(yīng)去除載體PUC18的5磷酸基團(tuán)，50反應(yīng)30 min以上DNA 20lCIAP（TaKaRa）0.5l10 × buffe

15、r 4.0lddH2O 15.5l770水浴10 min, 使CIAP失活；8按25步純化載體，溶于10 l ddH2O；9連接反應(yīng)（15l體系）：DNA 10lpUC18 2.5l5 × buffer 1.5lT4 ligase (3U/l) 1.0l16水浴過(guò)夜10轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞11轉(zhuǎn)化子的鑒定五、備注1. 根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮屯庠雌蔚牟煌蛇x用不同的載體，采用不同粘性末端的雙酶切可實(shí)現(xiàn)外源片段的定向克隆。2. 克隆中用到的幾種工具酶：（1）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的一個(gè)活性單位（1U）：指在50 l反應(yīng)體系中，37下，經(jīng)過(guò)1小時(shí)的反應(yīng)將1g DNA完全切割所需要的酶量。限制

16、性內(nèi)切酶的star活性：限制酶在某些條件下使用時(shí)對(duì)DNA切割的位點(diǎn)特異性可能降低，即可以切割與原來(lái)識(shí)別的特定DNA序列不同的堿基序列，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)與限制酶、底物DNA以及反應(yīng)條件有關(guān)。（2）堿性磷酸酶細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5磷酸殘基。比較而言，CIAP更常用，因其可在70 10內(nèi)加熱滅活或通過(guò)苯酚抽提而變性失活，同時(shí)CIAP的活性比BAP的高1020倍。它主要用于：（1）克隆時(shí)去除載體的5-P，以防載體自連；（2）在用 Kinase進(jìn)行5末端標(biāo)記前，去除DNA的5-P。（3）連接酶體外催

17、化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接酶，但幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是首選的酶，因其能在正常的反應(yīng)條件下能有效的將平端連接起來(lái)。3. 氯仿對(duì)眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時(shí)需戴手套、安全鏡并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。苯酚是強(qiáng)腐蝕劑，能引起嚴(yán)重?zé)齻?。操作時(shí)應(yīng)戴手套、安全鏡、穿防護(hù)服，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)四感受態(tài)細(xì)胞的制備體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方法處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和CaCl2法將外

18、源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，并需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和CaCl2感受態(tài)細(xì)胞。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)感受態(tài)細(xì)胞的制備過(guò)程二、實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌菌株DH5或DH10B三、實(shí)驗(yàn)原理電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔，因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)胞，以使細(xì)胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。轉(zhuǎn)化效率為1091010 轉(zhuǎn)化子/g DNA；對(duì)于熱激法，是利用冰冷的CaCl2處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化效率為106 107轉(zhuǎn)化子/g DNA。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞1前夜接種受體菌（DH5或DH10B），挑取單菌落于LB培

19、養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過(guò)夜（約16小時(shí)）；2取1ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時(shí)（250-300rpm）；3將0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作4吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10min；54下3000 g冷凍離心5min；6棄去上清，加入100l預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20min；74下3000 g冷凍離心5min；8棄去上清，加入100l預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸?。?細(xì)胞懸浮液可

20、立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑（15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫?0）。（二）、電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞1. 前夜接種受體菌（DH5或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過(guò)夜；2. 取2ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200ml LB培養(yǎng)基中，在37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD6000.6（約2.5-3小時(shí)）；3. 將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺(tái)和冰上操作4. 吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10min；5. 4下3000g冷凍離心5min；6. 棄去上清，加入1500l 冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；7

21、. 4下3000g冷凍離心5min8. 棄去上清，加入750l 冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮；9. 4下3000g冷凍離心5min10. 加入20l 冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；11. 立即使用或迅速置于-70ºC超低溫保存。五、備注影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)：(1) 細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過(guò)檢測(cè)OD600來(lái)控制。DH5菌株OD600為0.5時(shí)細(xì)胞密度是5×107/ml）；(2) 所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件和冰上進(jìn)行；(3)

22、 經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加，24小時(shí)達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的）；(4) 化合物及無(wú)機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；(5) 所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；(6) 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；(7) 一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；實(shí)驗(yàn)五質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d

23、體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諢峒しɑ螂娹D(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。二、實(shí)驗(yàn)材料外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。三、實(shí)驗(yàn)原理（1）熱激法：大腸桿菌在0 CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。（2

24、）電轉(zhuǎn)化法：外加于細(xì)胞膜上的電場(chǎng)造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于孔DNA等大分子進(jìn)入。同時(shí)DNA在電場(chǎng)中形成的極性對(duì)于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、熱激法轉(zhuǎn)化1制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250ml LA培養(yǎng)基中250l Amp（100mg/ml），250l X-gal (20mg/ml)，25l IPTG (200mg/ml)，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；2取出3管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；3每100l感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，3管分別加連接產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì)粒DNA（陽(yáng)性對(duì)照）及不加入任何DNA（陰性對(duì)照），用移液器

25、輕輕吸打均勻，在冰上放置30min；4熱擊：將離心管放置42水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動(dòng)離心管；5冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置12min；6復(fù)蘇：每管加400l SOC培養(yǎng)基，在37搖床溫和搖動(dòng)溫育45min，使細(xì)菌復(fù)蘇；7布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；8培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37培養(yǎng)1216小時(shí)即可觀察到藍(lán)白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色菌落是載體自連的轉(zhuǎn)化子）（二）、電轉(zhuǎn)化法1制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250ml LA培養(yǎng)基中250l Amp（100mg/ml），250l X-gal (20mg/ml)，

26、25l IPTG (200mg/ml)，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；2取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；3每管感受態(tài)細(xì)胞加入1l連接產(chǎn)物，用移液器輕輕吸打均勻，置冰上；4電轉(zhuǎn)化儀選擇1800V作為輸出電壓；5將要轉(zhuǎn)化的混合物加入預(yù)冷的1 mm的電轉(zhuǎn)化杯中，立即按下按紐電擊；6立即加1ml SOC培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)化杯中重懸細(xì)胞；7將細(xì)胞轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)管中37ºC培養(yǎng)1小時(shí)；8吸取合適體積的菌液涂布已倒好的選擇培養(yǎng)基平板；937ºC培養(yǎng)過(guò)夜，觀察結(jié)果。五、備注1利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板的密度要低（90mm平板上不得超過(guò)105個(gè)菌落），同時(shí)37培養(yǎng)不應(yīng)超過(guò)20小

27、時(shí)，具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周?chē)目股?，從而?dǎo)致對(duì)氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。2鑒定轉(zhuǎn)化子中是否含有外源DNA片段常用的方法有：(1) 互補(bǔ)；(2)雜交篩選；(3) 插入失活（一些老質(zhì)粒如pBR322等）;(4) 小量提取質(zhì)粒酶切檢測(cè)、PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)六植物總DNA的快速少量抽提DNA分子是分子生物學(xué)研究的基本材料，依不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目刹扇〔煌某樘岱椒ǐ@取數(shù)量和質(zhì)量不等的DNA。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵参顳NA抽提的主要方法，掌握SDS法抽提煙草DNA。掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。二、實(shí)驗(yàn)材料及試劑煙草葉片，水稻葉片，1.5×CTAB，氯仿

28、/異戊醇(24:1)，95%乙醇或無(wú)水乙醇等。三、實(shí)驗(yàn)原理植物DNA的抽提常采用兩種方法：（1）SDS法：離子去污劑，過(guò)程長(zhǎng)，純度高；（2）CTAB法：該方法簡(jiǎn)便、快速，DNA產(chǎn)量高(純度稍次，適用于一般分子生物學(xué)操作)。 CTAB是一種非離子去污劑，植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合65°C水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來(lái)。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再

29、用7075%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。再經(jīng)過(guò)氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來(lái)純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA沉淀分離出來(lái)。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）、SDS提取法1. 取0.1g-0.2g新鮮葉片，置液氮中研磨成粉。2. 將凍粉大致平均分配到兩個(gè)1.5mL的離心管中，各加入900L提取緩沖液，輕輕攪動(dòng)，使粉末充分散開(kāi)。3. 各加入100L 10%SDS，充分混勻，于65水浴中保溫10-30min,(間隔搖晃2-3次)。4. 各加入160L 5mol/L乙酸鉀，充分混勻，冰浴中放置30min 。5.4下12，000r/min離心15min。6. 上清液轉(zhuǎn)入新離

30、心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）,輕輕顛倒離心管數(shù)次，放置3-5min。7. 于4下8，000r/min離心10min 。8. 上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3倍體積、-20預(yù)冷的異丙醇，混勻，放置30min，觀察DNA沉淀生成。9. 于4下8，000r/m離心10min，傾去上清液，將離心管倒置于吸水紙上，控干上清液。10. 用80%的乙醇洗滌沉淀，吹干10-15min。11. 加入100LTE（含20ug/mL的RNase）緩沖液充分溶解(若溶解不好，可置37水浴中保溫1hr，促進(jìn)溶解)。12. 如需純化，則應(yīng)進(jìn)行步驟131613. 加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，放置幾mi

31、n后10，000r/min離心5min，重復(fù)1次。14. 轉(zhuǎn)移并量出上清液體積，置新離心管中，加入1/5倍體積的3mol/L NaAC，混勻，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕緩混勻，室溫放置數(shù)min。15.10，000r/min離心5-10min,按照9操作，去盡上清液。16. 用80%乙醇洗滌沉淀2-3次，吹干。17. 加入10L TE或ddH2O溶解DNA，備用。（二）、CTAB提取法1. 采集適量幼嫩葉片，用液N2研成粉末，0.4 g裝入1.5ml離心管中（-20預(yù)冷）。2. 預(yù)熱1.5×CTAB到95，加1ml到裝有葉片粉末的離心管中，混勻（防止凍融）。3. 立即置于65水浴3

32、0min，每5分鐘，上下顛倒1次。4. 12000g離心5分鐘。5. 吸取上清液約600l，加入等體積（600l）氯仿/異戊醇(24:1)，上下顛倒數(shù)次，至下層液相呈深綠色為止。6. 12000g離心5分鐘。7. 取450l上清于一新1.5ml離心管，加入1ml 95%乙醇和45l 10M NH4AC），混勻，室溫放置10min。8. 12000 g離心10min，去上清，用75% EtOH浸洗沉淀，自然干燥約30 min。9. 加入50l 1/10 TE或無(wú)菌水（含20g/RNase），置于4過(guò)夜，待DNA溶解后，檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。五、注意事項(xiàng)1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類(lèi)物質(zhì)多，必須

33、用10 mM的-ME處理2研缽預(yù)凍，粉末至加CTAB前不要融化324:1的氯仿/異戊醇抽提時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，轉(zhuǎn)移用的槍頭最好是剪寬了的4所用試劑必需滅菌手套六、思考題（1）DNA降解的可能原因（2）提高DNA產(chǎn)量的措施實(shí)驗(yàn)七總DNA質(zhì)量檢測(cè)及酶切一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庹莆諜z測(cè)DNA 質(zhì)量的方法以及DNA定量的方法；了解影響DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)速率的因素；訓(xùn)練DNA的瓊脂糖凝膠電泳操作及DNA的限制性內(nèi)切酶操作。二、實(shí)驗(yàn)原理參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二；限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：見(jiàn)“基因操作原理”。三、實(shí)驗(yàn)材料及試劑水稻總DNA或BAC克隆DNA，瓊脂糖，限制性內(nèi)切酶DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII 四、實(shí)驗(yàn)

34、步驟1取10l DNA于0.8% 凝膠檢測(cè)；2將DNA調(diào)節(jié)濃度至300-400 ng/l ；2仔細(xì)閱讀將所用的任何一種酶產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，熟悉反應(yīng)條件及酶切的貯存濃度（10U-50U/l）廠家配套試劑；3計(jì)算據(jù)反應(yīng)條件所需要的各種試劑準(zhǔn)確用量：（0.5 ml tube中）DNA(3-5g) 10l10× buffer reaction 1.5lEnzyme (15 U/l) 0.8l（冰上）ddH2O2.7l混勻，短暫離心；437溫浴1-2 hrs (純DNA) 或10 hrs（粗制DNA）；5加入上樣緩沖液終止酶切反應(yīng)，也可65加熱10 min使酶變性失活；6電泳檢測(cè)酶切效率：每個(gè)樣品取

35、1/10量用瓊脂糖電泳檢測(cè)，制膠及點(diǎn)樣方法同上。五、結(jié)果分析1、若水稻DNA呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則需重做；2、DNA被切斷：DNA降解，重新提DNA；3、DNA切不動(dòng)：雜質(zhì)多（多糖，蛋白質(zhì)，酚類(lèi)，有機(jī)溶劑等），重新純化；4、若是BAC克隆DNA，酶切后應(yīng)出現(xiàn)多條很清晰的不同大小DNA帶。六、思考題1、什么是酶星活性？如何避免？2、影響酶切效率的因素？3、EB指示劑原理？實(shí)驗(yàn)八 PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中的常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于分

36、子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誔CR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過(guò)程二、實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因水稻葉片總DNA，外源基因的特異引物三、實(shí)驗(yàn)原理PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)，介于兩個(gè)引物之間的特異DNA片段得到大量擴(kuò)增。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 調(diào)整模板濃度至10 ng/l；2. 按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，加一滴礦物油，離心5秒Template DNA 2 .0l （20 ng）10× buffer2.0 lMgCl2（25mM）1.5 lPrimer F (

37、10M) 0.2 lPrimer R (10M) 0.2 ldNTPs（2mM）2.0 lTaq（5U/l） 0.2 lAdd ddH2O to 20 l3PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：953' 1 cycle 941' 551' 721'30" 35 cycles 728' 1 cycle 4forever 4檢測(cè)：加2l溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15l反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳；5在1%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳；EB染色，紫外觀察。五、備注1引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；2PCR反應(yīng)的各種成份不能遺漏，

38、操作應(yīng)戴手套，冰上操作；3根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度以及PCR儀的特性來(lái)設(shè)定PCR循環(huán)條件；4注意分析電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無(wú)DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。第二部分 蛋白質(zhì)的分離、純化動(dòng)物肝臟過(guò)氧化氫酶的提取分離純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)和掌握從動(dòng)物細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)的方法及其原理。2、學(xué)習(xí)和掌握用紫外分光光度計(jì)測(cè)定酶活的原理及方法。3、學(xué)習(xí)和掌握離子交換層析法的基本原理和層析分析蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)操作方法。4、學(xué)習(xí)和掌握SDS凝膠電泳的原理和操作方法，學(xué)會(huì)利用SDS凝膠電泳來(lái)鑒定蛋白質(zhì)的純度和測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。二、實(shí)驗(yàn)原理過(guò)氧化氫酶是一種可溶性蛋白酶，廣泛存在于動(dòng)

39、植物和微生物細(xì)胞中，哺乳動(dòng)物的肝與紅細(xì)胞含量較高。過(guò)氧化氫酶是一種含鐵卟啉的酶，該酶能催化過(guò)氧化氫分解成氧和水，對(duì)減輕機(jī)體活性氧損傷具有一定的意義。本實(shí)驗(yàn)以雞肝為材料，學(xué)習(xí)從動(dòng)物細(xì)胞中提取酶的方法和技術(shù)。首先從雞肝中提取可溶性的蛋白質(zhì)，并測(cè)定其蛋白質(zhì)的含量和過(guò)氧化氫酶的活力；然后采用硫酸銨分級(jí)鹽析、DEAE纖維素梯度洗脫來(lái)分離純化過(guò)氧化氫酶；分部收集洗脫組分，并測(cè)定過(guò)氧化氫酶活力，將酶活力高的組分合并；最后采用SDS-凝膠電泳鑒定過(guò)氧化氫酶的純度和測(cè)定其分子量。三、主要儀器、材料和試劑主要儀器：紫外分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、超聲波破碎儀材料及試劑：雞、樣品提取緩沖液：稱(chēng)取Tris 0.606g，

40、KCl 0.746g，甘油20.00g，加雙蒸水到總體積100ml，用HCl調(diào)pH至7.1。硫酸銨。其余見(jiàn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、肝臟研磨液的制取取新鮮的肝臟(如豬肝、雞肝、兔肝等)去掉其中非肝細(xì)胞部分(如大血管、膽、脂肪等)，用刀切成小塊，冷凍至4以下，放在多功能豆?jié){機(jī)內(nèi)攪成糊狀，制成肝臟研磨液。2、水浸提法提取過(guò)氧化氫酶按研磨液與水的體積比為1:5計(jì)算，加入相應(yīng)體積的蒸餾水浸提，浸提溫度為25，浸提時(shí)間為5 h左右。4下以10000r/min離心20 min，得上清液備用。3、將浸提液分為3份：一份用于測(cè)總蛋白含量及過(guò)氧化氫酶活性：一份保存冰箱中用于最后SDS-PAGE電泳；另取一份用于

41、鹽析、透析等。4、過(guò)氧化氫酶粗酶液的鹽析及透析先測(cè)量提取液的總體積，根據(jù)附錄后的硫酸銨飽和度的常用表計(jì)算需加的硫酸銨的量（一般用0的表）。（1）將硫酸銨研磨成粉末加入粗酶液中，使達(dá)40%飽和度（使大部分雜蛋白沉淀），在電磁攪拌器上邊攪拌邊加入，然后置冰箱放置12h；注意：加硫酸銨時(shí)要緩慢，以避免造成局部濃度過(guò)高。（2）12000 r/min冷凍離心20min。收集上清液S1（取部分上清液測(cè)總蛋白及酶活性），上清液中再加入硫酸銨使達(dá)80%飽和度，12000r/min冷凍離心20min，收集上清液S2（取部分上清測(cè)總蛋白及酶活性）。注：蛋白含量測(cè)定見(jiàn)實(shí)驗(yàn)1或2，酶活力測(cè)定見(jiàn)實(shí)驗(yàn)3）。（3）將第二次

42、離心的沉淀復(fù)溶于1/20原始體積的緩沖液中，裝入透析袋中，用大量的此緩沖液在冰箱中進(jìn)行透析過(guò)夜（4），其間更換緩沖溶液約3-4次，直至無(wú)白色沉淀析出為止（用BaCl2溶液檢查）。透析完畢后，將提取液保存于冰箱中備用，取部分測(cè)酶比活性，也可留部分在最后進(jìn)行SDS電泳。注：透析袋一般采用賽璐璐和賽璐璐酚等材料做成，使用前需處理，以消除附著的重金屬、蛋白水解酶和核酸酶。處理時(shí)，將透析袋放入0.5mol/l的EDTA溶液中煮半個(gè)小時(shí)，棄去溶液，換上水，再煮幾次，貯存在含0.01%的NaN3水中（4）。使用時(shí)，只能用鑷子或戴手套操作。5、透析后的過(guò)氧化氫酶采用DEAE離子交換層析純化（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)4）。采用分

43、步洗脫法洗脫，即先用洗脫液A洗脫1個(gè)柱體積（收集在一個(gè)試管中），流速約0.5ml/min；然后用洗脫液B中a-f的6個(gè)梯度分別洗脫一個(gè)柱體積，分別收集，流速約0.5ml/min；如下圖。蛋白質(zhì)分步洗脫曲線收集各個(gè)洗脫組分，測(cè)定每個(gè)組分的過(guò)氧化氫酶含量及酶活力，將活力較高的洗脫組分進(jìn)行SDS凝膠電泳。注：洗脫液A用磷酸鹽緩沖液（0.1mol/l, pH7.0）洗脫液B用0.05-0.5mol/L的NaCl, 磷酸鹽緩沖液（0.1mol/l, pH7.4）：須配制a-f的6種磷酸鹽緩沖液（0.1mol/l, pH7.4）各2倍柱體積，其中a-f的NaCl濃度分別為mol/l、b.0.1mol/l、

44、c.0.2mol/l、d.0.3mol/l、e.0.4mol/l、f.0.5mol/l。6、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)蛋白的相對(duì)分子量（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)5）。將上述各步得到的樣品（粗酶提取液、鹽析后、透析后、層析后）與標(biāo)準(zhǔn)蛋白一起進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。7、結(jié)果分析將實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所得數(shù)據(jù)填于下表中，并測(cè)出純化后過(guò)氧化氫酶的分子量。酶液酶液總體積（ml）蛋白質(zhì)（mg/ml）酶活性（U/ml）總活性（U）比活性U/(mg.N)回收率（%）純化倍數(shù)粗酶液上清S1上清S2透析后層析后8、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求撰寫(xiě)3000字左右的實(shí)驗(yàn)研究論文，標(biāo)注參考3篇以上。五、備注比活力 = 每ml樣品中過(guò)氧化氫酶活力單位數(shù)

45、/每ml樣品中蛋白的質(zhì)量純化倍數(shù) = 各階段比活力數(shù)/粗酶液的比活力回收率 = 各階段酶的總活力單位/粗酶液中的總活力數(shù)動(dòng)物血中超氧化物歧化酶的提取與純化一、超氧化物歧化酶的提取 原理 l969年，McCord和Fridovich第一次從牛血中提純到超氧化物岐化酶。自然界中SOD分布極廣，其含量隨生物體的不同而不同，即使同一種生物的不同組織或同一組織的不同部位，其SOD的種類(lèi)和含量也有很大差別。迄今為止人們已從細(xì)菌，真菌、原生動(dòng)物。藻類(lèi)、昆蟲(chóng)、魚(yú)類(lèi)、植物和動(dòng)物等各種生物體內(nèi)分離得到SOD。為拓寬提取SOD的原料，篩選或基因過(guò)程開(kāi)發(fā)產(chǎn)SOD量較高的菌株。目前，研究開(kāi)發(fā)最多的資源還是從動(dòng)物血液、動(dòng)

46、物組織中制備提純SOD。 從動(dòng)物血液材料中制備Cu Zn-SOD純化工藝分為三個(gè)主要步驟： （1）原材料的預(yù)處理； （2）粗酶液的制備； （3）離子交換柱層析精制。 國(guó)內(nèi)多采用Mccord和Fridovich法，其主要工藝過(guò)程為： 第一步，乙醇-氯仿除去血紅蛋白； 第二步，有機(jī)溶劑和硫酸銨分級(jí)沉淀； 第三步，離子交換柱層析精制。 試劑和器材 1、試劑 3.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）檸檬酸三鈉；0.9%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氯化鈉 ；95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇；氯仿；丙酮 ；pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液 ；DEAE-Sephadex A-50 2、器材 豬血；恒溫水浴 ；離心機(jī) ；布

47、氏漏斗；抽濾瓶；燒杯、量筒、攪棒等；透析袋 方法和步驟 1、從豬血中提取SOD （1）分離血球 取新鮮豬血，加入到3.8%檸檬酸三鈉抗凝液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3：1，輕輕攪拌均勻，4 000r/min離心20min，收集紅血球。 （2）除血紅蛋白 紅血球用3倍體積生理鹽水洗滌，4 000r/min離心20min，重復(fù)三次，然后向洗凈的紅血球加入11.1倍體積去離子水，攪拌溶血30min，再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預(yù)冷95%乙醇和0.15倍體積的預(yù)冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h，然后4 000r/min離心20min除去變性血紅蛋白沉淀，取清液，過(guò)濾，收集濾液（記

48、錄體積，測(cè)酶活性和蛋白濃度）。 （3）熱變性 上清液加熱到65，保溫10min，然后迅速冷卻到室溫，3 000r/min離心20min，棄去沉淀物，收集上清液（記錄體積，測(cè)酶活性和蛋白濃度）。 （4）沉淀 清液在鹽冰浴中冷卻，然后在-5以下的操作溫度下，加入1.5倍量預(yù)冷丙酮，邊加邊攪拌均勻，即有白色沉淀產(chǎn)生，靜置23min，迅速抽濾，棄去濾液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸餾水溶解，4 000r/min離心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液透析，即得粗SOD溶液（記錄體積，測(cè)酶活性和蛋白濃度）。二、離子交換層析純化超氧化物歧化酶原理 本實(shí)驗(yàn)利

49、用超氧化物歧化酶的解離性質(zhì)，在一定緩沖液條件下與離子交換纖維素吸附和解吸的能力不同于溶液中雜蛋白，進(jìn)而除去雜蛋白。實(shí)驗(yàn)中選用DE-32離子交換纖維素。 相關(guān)原理請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)教材中離子交換層析一章。 試劑和器材 1、試劑 DE-32 ；緩沖液：2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） ；緩沖液：200mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH7.6） 2、器材 層析柱(2.5cm×25cm)；部分收集器 ；梯度洗脫儀；紫外分光光度計(jì)；試管、透析袋 方法和步驟 1、DEAE-纖維素的預(yù)處理： （1）稱(chēng)取5gDE-32，撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的燒杯

50、中，室溫放置30min，不時(shí)輕輕攪拌。 （2）將糊狀物移入3號(hào)砂芯漏斗中，用蒸餾水淋洗。如此重復(fù)，每加一次去離子水，浸泡一段時(shí)間，再進(jìn)行抽濾，至洗滌液pH等于4即可（pH試紙?jiān)嚕?（3）將糊狀物移入燒杯中，加入75mL 0.5mol/L NaOH，放置30min，不時(shí)輕輕攪拌，棄去上清液，依同法用0.5mol/L NaOH再處理一次。 （4）將交換劑移入3號(hào)砂芯漏斗中，反復(fù)用去離子水淋洗，直至洗滌液pH為8.0（可用pH試紙測(cè)試）。 （5）將DEAE-纖維素浸泡在150mL去離子水中。用0.5mol/L 鹽酸把pH調(diào)至7.6，滴定可在pH計(jì)上進(jìn)行，須使懸液最終pH在10min內(nèi)無(wú)變化，然后抽

51、濾。 （6）將上述濾塊置于100毫升量筒中，加入75mL緩沖液I，慢慢攪混之后，靜置20min，用傾斜法除去上清液中細(xì)微粒子，如此重復(fù)若干次，最后上清液pH與緩沖液I幾乎一致。 2、裝柱 （1）層析柱用洗滌液洗清潔，柱的下端聯(lián)接塑料管，裝上螺旋夾。關(guān)上螺旋夾，柱內(nèi)裝入緩沖液I，微開(kāi)螺旋夾。讓緩沖液緩慢流出，趕走死區(qū)及塑料管中的氣泡，柱中保留少量緩沖液，關(guān)閉螺旋夾。 （2）將基本平衡好的DEAE-纖維素漿液（約有1倍體積的緩沖液I）放在抽濾瓶中減壓除盡氣泡，然后沿管壁倒人柱中，待沉降至床高約1cm高度時(shí)，部分旋松螺旋夾，讓溶液緩慢流出去，注意此時(shí)的流速要比正常洗脫時(shí)的流速慢，陸續(xù)加入較多的漿液，

52、直至達(dá)到高10cm以上的柱床體積。 3、平衡 當(dāng)全部交換劑裝入柱中后，用上柱起始緩沖液進(jìn)行平衡。流速可維持在4mL/15min，直至流出液的pH與上柱緩沖液完全相同。（一般要平衡8h以上或過(guò)夜。） 4、層析 用毛細(xì)吸管小心吸去交換劑上面大部分液體，打開(kāi)出口使緩沖液恰流到表面，關(guān)閉出口。用毛細(xì)吸管小心地沿柱壁四周緩緩加入SOD粗酶液，打開(kāi)出口，使樣品溶液進(jìn)入纖維素內(nèi)，至幾乎露出床面時(shí)，柱壁用少量緩沖液小心洗滌23次，然后裝入緩沖液，使液面高出創(chuàng)面23 cm左右。 5、洗脫 （1）按圖將梯度洗脫器和層析柱連接好。 （2）在洗脫瓶A（貯存器）和洗脫瓶B（混合器）內(nèi)各裝入100mL緩沖液和緩沖液，注意

53、兩洗脫瓶，特別是液面應(yīng)處于同一水平面，同時(shí)應(yīng)排除連接管內(nèi)氣泡。 （3）開(kāi)動(dòng)電磁攪拌器開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)攪拌速度，以混合器內(nèi)緩沖液旋轉(zhuǎn)而無(wú)明顯旋渦為宜。 （4）將兩瓶和柱上下連接管道打開(kāi)，開(kāi)始收集洗脫流出液，控制流速在1.5mLmin。 收集液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和酶活性。 （5）收集合并具有SOD活性部分的洗脫液，透析濃縮后冷凍干燥即得純化SOD（淡藍(lán)綠色產(chǎn)品）。 三、超氧化物歧化酶的活性測(cè)定SOD)廣泛存在于生物體內(nèi)的含Cu、Zn、Mn、Fe的金屬類(lèi)酶。它作為生物體內(nèi)重要的自由基清除劑，可以清除體內(nèi)多余的超氧陰離子，在防御生物體氧化損傷方面起著重要作用。離子(O2 -)是人體氧代謝產(chǎn)物，它在體內(nèi)過(guò)量積累會(huì)

54、引起炎癥、腫瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧陰離子與生物體內(nèi)許多疾病的發(fā)生和形成有關(guān)。由于SOD能專(zhuān)一消除超氧陰離子(O2 -)而起到保護(hù)細(xì)胞的作用，SOD作為一種藥用酶，具有廣闊的應(yīng)用前景，并引起了國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界、生物界和食品界的極大關(guān)注。 按金屬輔基成分的不同可分成3種類(lèi)型。最常見(jiàn)的一種含有銅鋅金屬輔基(CuZn-SOD)，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在高等植物的葉綠體基質(zhì)、類(lèi)囊體內(nèi)以及線粒體膜間隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量約為3.2×104，純品呈藍(lán)綠色，每個(gè)酶分子由2個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)鍵的疏水基相互作用締合成二聚體。每個(gè)亞基(肽鏈)含有銅、鋅原子各一個(gè)，活性中心的核心是銅。第二種含有錳離子(Mn-SOD)，主要存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞中，在植物的葉綠體基質(zhì)和類(lèi)囊體膜上也有存在，純品呈粉紅色，由4條或2條肽鏈組成。第三種是Fe-S0D，過(guò)去一直認(rèn)為只存在于原核細(xì)胞中，近來(lái)發(fā)現(xiàn)有一些真核藻類(lèi)甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD純品呈黃色或黃褐色，由2條肽鏈組成，多數(shù)情況下每一個(gè)二聚體中含有一個(gè)Fe原子。 原理 SOD的活力測(cè)定方法很多，常見(jiàn)的有化學(xué)法、免疫法和等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最