realtimePCR和RT-PCR詳解及其區(qū)別要點(diǎn)

1、real-timePCR 技術(shù)的原理及應(yīng)用摘要：一、實(shí)時(shí)熒光定量 PCRM 理（一）定義：在 PCR5 應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCF0 程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。（二）實(shí)時(shí)原理 1、常規(guī) PCRK 術(shù)： 對 PCFT 增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)一、實(shí)時(shí)熒光定量 PC 麗理（一）定義：在 PC 皈應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCF0 程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。（二）實(shí)時(shí)原理1、常規(guī) PCRK 術(shù)：對 PCFT 增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法

2、對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測。2、實(shí)時(shí)定量 PC 敬術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測 PCFT 增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過 Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析3、如何對起始模板定量?通過 Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析4、幾個(gè)概念：(1)擴(kuò)增曲線：每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集(2)熒光閾值:熒光信號(hào)閾值熒光信號(hào)閾值(threshold)工工 前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)baseline.既樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的毅光信號(hào)的驚準(zhǔn)儲(chǔ)差的10倍 手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的黃光最高值,同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指

3、數(shù)期的最初階段， 并且保證回歸系數(shù)大于099 真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值(3)Ct 值:黃幫程測元件統(tǒng)壁標(biāo)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Cycte，級(jí)坐標(biāo):熒光atftUUBftUUB。鑿JWLLJWLLCt值的定義：PCR擴(kuò)增過程中， 擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)Ct值的特點(diǎn)工值的特點(diǎn)工相同模板進(jìn)行9敬擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定3織軸：黃光信號(hào)量C(f)valueCT 值的重現(xiàn)性:寸與Replicties橫軸 mPCR反映循環(huán)數(shù)CycIeHumber-Ct值則極具重現(xiàn)性5、定量原理：理想的 PC 皈應(yīng)：X=X0*2n非理想的 PCR5 應(yīng)：X=Xo(1+Ex)n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X

4、:第 n 次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex:擴(kuò)增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線模板模板DNA量越多量越多, ,熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少, ,即即Ct值越小值越小Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值值, ,就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量6、絕對定量1)確定未知樣品的 C(t)值2)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的 C(t)值推算出其初始量7、DNA 勺熒光標(biāo)記:非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記:、工四Man，3、Mo

5、lecularBeacon二、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 勺幾種方法介紹方法一：SYBRGreen 法（一）工作原理1、SYBRGreen 能結(jié)合到雙鏈 DNA 勺小溝部位Tm值，DNA解鏈一半時(shí)的溫度SGSGSGSGEmssionilliiiiiFIiIIiiiiHinIrF11i111H11mir13O.JH.Ullin,mimin11in1J.UIUJ.1.111UU.Miu_引SGSGSG2、SYBRGreen 只有和雙鏈 DNA 吉合后才發(fā)熒光3、變性時(shí)，DN 敏鏈分開，無熒光4、復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈 DNASYBRGreen 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)NoEmissionExcita

6、tio將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。（-dl/dT）模板模板DNA量越多，熒光達(dá)到量越多，熒光達(dá)到攵越少攵越少9qErw9qErw804)804)Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值值. .就可以計(jì)算就可以計(jì)算PC 皈應(yīng)體系的建立及優(yōu)化1、SYBRGreen 使用濃度：太高抑制 Taq 酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測2、Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)3、MgCl2 勺濃度：可以降低到 1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物4、反應(yīng) Buffer 體系的優(yōu)化5、反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù)：由酶和引物決定6、其他與常規(guī) PCN 目同（二）應(yīng)用范圍

7、1、起始模板的測定；2、基因型的分析；3、融解曲線分析：可以優(yōu)化 PCR5 應(yīng)的條件，對常規(guī) PCRt 指導(dǎo)意義，如對 primer 的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。（三）優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對 DNAJI 板沒有選擇性；適用于任何 DNA 使用方便；不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針；非常靈敏；便宜。缺點(diǎn)：容易與非特異性雙鏈 DNA 吉合，產(chǎn)生假陽性；但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件；對引物特異性要求較高。方法二：TaqMan-水解型雜交探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)*5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)*3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)*探針完整，R 所發(fā)射的熒光能量被

8、Q 基團(tuán)吸收，無熒光，R與 Q 分開，發(fā)熒光*Taq 酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針(一)工作原理注意：每擴(kuò)增一條 DN 粉子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光PC 皈應(yīng)的建立：1、引物、探針的設(shè)計(jì):ProbeReporterQuencher,如 FAMVIC 等探針 Tm 為 68-70C,30bp,5不能有 G,G 可能會(huì)淬滅熒光引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400bp,引物 Tm為59-60C2、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94C,10-20S60C,30-60S（Taq 酶 53外切核酸酶活性在 60C 最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72C,45S,3、優(yōu)化引物和探

9、針濃度：獲得最小 Ct 值，信號(hào)/背景比值的最大引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī) PCRlf 同（二）優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對目標(biāo)序列的高特異性-陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對簡單-與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好缺點(diǎn)：只適合一個(gè)特定的目標(biāo)；委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高；不易找到本底低的探針Real-timePCR 與 RT-PCRt 匕較2009-08-2016:50:02 來源：未知【大中小】評(píng)論：條摘要：Real-timePCR 與 RT-PC 幅兩種不同的 PC 昉法，適用范圍也不同。Real-timePCR 中文譯作實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)， 是一種最新發(fā)展的定量 PCRK術(shù)。該技

10、術(shù)借助于熒光信號(hào)來檢測 PCFT 物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到 PC 陶循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)Real-timePCRt 段的合適瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（）線性 DNAt 段的有效分離范圍（kb）0.51-300.70.8121.10.5101.20.4-70.2-3六、需注意的問題：1、注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、澳化乙錠（EB）、酚、異硫富酸服、紫外線等2、注意避免試劑污染3、始終注意避免 RNA1 的污染：4、保管好自己專用的試劑，公用試劑保管好，相互協(xié)調(diào)，注意實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生RealtimePCR 跟 RT-PCRt 什么區(qū)別關(guān)鍵詞：reajtimeP

11、CRRT-PCR 區(qū)別 I?2008-07-2300:00 來源:丁香園點(diǎn)擊次數(shù)：4932實(shí)時(shí)熒光定量 PCRM 理所謂實(shí)時(shí)熒光定量 PC 做術(shù)，是指在 PC 皈應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCFffi 程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。.內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測， 即 PCRIU 達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測， 而 PCRg過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在 96 孔 PCFa上做 96 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。.實(shí)時(shí)熒光定量 PCRB 需內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量 PCRK 術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品 Ct 值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量 PCRB 需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：Ct 值的重現(xiàn)性PCR