HPLC培訓(xùn)教材2

1、色譜流動(dòng)相概念介紹色譜流動(dòng)相概念介紹 流動(dòng)相導(dǎo)論流動(dòng)相導(dǎo)論v溶劑系統(tǒng)可以是一種或多種水溶液 或有機(jī)溶劑攜帶樣品流經(jīng)色譜柱至檢測(cè)器 當(dāng)與樣品發(fā)生相互作用時(shí)，樣品則發(fā)生分離 v選擇溶劑需考慮的問(wèn)題 極性與溶劑強(qiáng)度 純度、過(guò)濾、除氣 與其他溶劑的互溶性 緩沖溶液與pH等梯度或梯度洗脫分析 流動(dòng)相的要求v流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。v純度純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱

2、上積累時(shí)。v必須與檢測(cè)器匹配必須與檢測(cè)器匹配。使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒(méi)有吸收，或吸收很小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。v粘度要低（應(yīng)粘度要低（應(yīng)2cp100 一一般般用用裝裝柱柱機(jī)機(jī) 制制備備柱柱 25-100 半半制制備備柱柱 5-25 毫毫克克級(jí)級(jí)至至克克級(jí)級(jí)制制備備 分分析析柱柱 2-5 典典型型為為4.6 mm 細(xì)細(xì)徑徑管管柱柱 0.8-0.2 金金屬屬柱柱或或PEEK柱柱 毛毛細(xì)細(xì)管管柱柱 0.05-0.5 填填充充柱柱或或開開管管柱柱 微微徑徑管管柱柱 納納米米管管柱柱 100 um、傳質(zhì)速度慢、柱效低中期：

3、薄殼型硅膠固定相v玻璃珠涂敷硅膠顆粒層 v30-40 um、孔徑均一，滲透性好， 溶質(zhì)擴(kuò)散性快 v高效、分離快速，但樣品負(fù)載量低后期：全多孔微粒v2000溶于水溶于水分子量分子量2000溶于溶于 THF分子量分子量4 倍則更加保險(xiǎn)倍數(shù)進(jìn)進(jìn) 樣樣進(jìn)進(jìn) 樣樣 量量全定量環(huán)進(jìn)樣全定量環(huán)進(jìn)樣準(zhǔn)確，但浪費(fèi)樣品至少需要2.5倍進(jìn)樣體積的樣品部分定量環(huán)進(jìn)樣部分定量環(huán)進(jìn)樣進(jìn)樣量 進(jìn)樣環(huán)體積的一半無(wú)層流效應(yīng)的影響誤差來(lái)源于進(jìn)樣針及操作人員使用內(nèi)標(biāo)法將可以提高進(jìn)樣的準(zhǔn)確度檢檢 測(cè)測(cè) 器器 作用：作用：檢測(cè)色譜柱流出物組份濃度的變化理想的檢測(cè)器：理想的檢測(cè)器： 靈敏度高 對(duì)所有溶質(zhì)都有快速的相應(yīng) 不引起柱外譜帶擴(kuò)展

4、 線性范圍寬 對(duì)樣品無(wú)破壞性 檢測(cè)器響應(yīng)對(duì)流量及溫度變化不敏感檢檢 測(cè)測(cè) 器器 分分 類類按檢測(cè)對(duì)象分類按檢測(cè)對(duì)象分類 整體性檢測(cè)器：檢測(cè)流動(dòng)相的總體物理性質(zhì) 如：示差折光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器 靈敏度低、易受溫度影響的波動(dòng)、不適合梯度洗脫 溶質(zhì)性檢測(cè)器：測(cè)量溶質(zhì)的某種特性或物化性質(zhì)的變化 如：紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器 流動(dòng)相不能有紫外吸收按選擇性分類按選擇性分類 選擇性檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器 通用性檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器檢檢 測(cè)測(cè) 器器 分分 類類v1）按原理分：為光學(xué)檢測(cè)器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射）、熱學(xué)檢測(cè)器（如吸附熱）、電化學(xué)檢測(cè)器（如極譜、庫(kù)侖、安培）、電學(xué)

5、檢測(cè)器（電導(dǎo)、介電常數(shù)、壓電石英頻率）、放射性檢測(cè)器（閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測(cè)器。v2）按測(cè)量性質(zhì)分：為通用型和專屬型（又稱選擇性）。v通用型檢測(cè)器測(cè)量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì)，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng)，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。通用型的靈敏度一般比專屬型的低。v專屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，如紫外、熒光檢測(cè)器，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。v3）按檢測(cè)方式分：濃度型和質(zhì)量型。v濃度型檢測(cè)器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測(cè)器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)器的組分的量有關(guān)。v4）檢測(cè)器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種。檢測(cè)器的噪音和漂

6、移檢測(cè)器的噪音和漂移 噪音和漂移反應(yīng)了檢測(cè)器的穩(wěn)定性噪音和漂移反應(yīng)了檢測(cè)器的穩(wěn)定性 噪音噪音 無(wú)溶劑通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，輸出信號(hào)的變化 電路及泵的脈沖引起短噪音，不影響色譜峰的分辨率，但影響檢測(cè)限 長(zhǎng)噪音來(lái)自檢測(cè)器本身、或流動(dòng)池有氣泡，溫度及流量的變化也會(huì)引起長(zhǎng)噪音 漂移漂移 基線隨時(shí)間增加朝單一方向偏移 電源電壓不穩(wěn)、溫度及流動(dòng)相發(fā)生緩慢變化 對(duì)分析誤差及檢測(cè)能力有影響檢測(cè)器的技術(shù)指標(biāo)檢測(cè)器的技術(shù)指標(biāo)靈敏度靈敏度 檢測(cè)器的主要性能指標(biāo)，樣品進(jìn)入檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào) 靈敏度越高檢測(cè)限越低檢測(cè)限檢測(cè)限 兩倍噪音時(shí)所需要的樣品量 檢測(cè)限小、檢測(cè)性能強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)所需要的樣品少線性范圍線性范圍 檢測(cè)信號(hào)與被檢測(cè)物

7、呈線性關(guān)系的范圍 下限定義為兩倍噪音紫外紫外- -可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器應(yīng)用范圍最廣泛的檢測(cè)器應(yīng)用范圍最廣泛的檢測(cè)器 大約占使用的70% 紫外光區(qū)：190370nm；可見(jiàn)光區(qū)：370700nm特點(diǎn)特點(diǎn) 靈敏度高、噪音低、線性范圍寬 為溶質(zhì)型檢測(cè)器、對(duì)流速和溫度的變化不敏感 為選擇性檢測(cè)器，必須使用無(wú)紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相為濃度型檢測(cè)器 為非破壞性檢測(cè)器，可與制備色譜或其他設(shè)備串聯(lián) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、維護(hù)方便I0IAbsorbedradiationTransmitted radiationIncident radiationReflectionbv A = log ( ) = a b cIoI紫外

8、紫外- -可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器工作原理可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器工作原理朗伯朗伯- -比爾定律：比爾定律：吸光度與化合物的濃度成正比檢測(cè)器流通池檢測(cè)器流通池ProStar 325 檢測(cè)器檢測(cè)器雙光程設(shè)計(jì)雙光程設(shè)計(jì) 適合高低濃度的檢測(cè) 可用于制備色譜的線性放大 可更換式流量池 不需要復(fù)雜的校準(zhǔn)程序示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器 v通用型檢測(cè)器 溶劑選擇合適幾乎可測(cè)所有的物質(zhì) v原理折射率：光在真空的速度和在某介質(zhì)中的速度之比光 光由一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)發(fā)生折射現(xiàn)象 折射率隨溫度升高而降低 同一介質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光有不同折射率 示差折光檢測(cè)器的特點(diǎn)示差折光檢測(cè)器的特點(diǎn) v屬通用型檢測(cè)器響應(yīng)值取決于柱后流出液折射率變

9、化 適合檢測(cè) v無(wú)紫外吸收的物質(zhì) v流動(dòng)相溶劑具有高紫外吸收 v濃度敏感型檢測(cè)器 響應(yīng)信號(hào)與溶質(zhì)濃度成正比 v中等靈敏度檢測(cè)器 不適合痕量分析 示差折光檢測(cè)器的特點(diǎn)（續(xù)）示差折光檢測(cè)器的特點(diǎn)（續(xù)）v對(duì)壓力、溫度變化相當(dāng)敏感 需配置柱溫箱 v最常用的溶劑是水 不適合梯度洗脫 v檢測(cè)要求 流動(dòng)相組成須恒定 控制恒溫 控制壓力恒定 v出口處不可以加限流 裝置 v檢測(cè)器串聯(lián)時(shí)，RI應(yīng) 放在最后 水甲醇和水水甲醇和水CH3CN混合物折射率混合物折射率 泵的維護(hù)保養(yǎng)（每日）泵的維護(hù)保養(yǎng)（每日）v每日維護(hù)保養(yǎng)檢查并記錄壓力是否在正常范圍 使用完畢后清洗流程 v先以水清洗v再以 ACN 或 MeOH 清洗v并

10、且將有機(jī)溶劑保留在系統(tǒng)中 v避免細(xì)菌滋生v每周維護(hù)保養(yǎng) 若使用緩沖溶液必須清洗比例閥若 v先以水清洗v再以 ACN 或 MeOH 清洗以水清洗 piston seal檢查溶劑瓶過(guò)濾頭是否暢通 v每月維護(hù)保養(yǎng)以超聲波、蒸餾水清洗溶劑瓶 檢查 prime 是否困難以觀察出口閥濾膜是否堵塞 泵的維護(hù)保養(yǎng)（每周、月）泵的維護(hù)保養(yǎng)（每周、月）六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)v樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45m濾膜過(guò)濾，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。v轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過(guò)泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過(guò)高的壓力將使柱頭損壞。v為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，

11、每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。 泵的簡(jiǎn)易故障排除泵的簡(jiǎn)易故障排除v分析柱壓力每日記錄 v電源開啟失敗檢查插頭、電線及保險(xiǎn)絲 v開啟后儀器自檢 若失敗，請(qǐng)記錄 Error Log （視機(jī)型而定）檢查操作手冊(cè)泵的簡(jiǎn)易故障排除泵的簡(jiǎn)易故障排除 壓力過(guò)壓力過(guò)高高v壓力過(guò)高混合室 0.5um 濾膜阻塞，更換濾膜 色譜柱或預(yù)柱的 frit 阻塞， 倒沖或更換 frit，樣品與溶劑需 過(guò)濾不恰當(dāng)?shù)牧魉伲瑱z查管柱 ID以及溶劑程序 高黏度溶劑，開發(fā)方法、改變 溶劑黏度 管路系統(tǒng)阻塞，從檢測(cè)器往輸液泵檢查，找出問(wèn)題點(diǎn)。 輸液泵簡(jiǎn)易故障排除輸液泵簡(jiǎn)易故障排除

12、壓力過(guò)低v壓力顯示過(guò)低 未進(jìn)行 prime，入口管路存在空氣 purge 和 prime 閥未關(guān)好 系統(tǒng)漏，檢查接頭處 活塞漏，觀察溶劑是否從泵頭 后面漏出 出口或入口單向閥損壞 、更 換新閥比例閥阻塞，操作時(shí)聽不到比例閥 工作的聲音 溶劑瓶中的溶劑太少，檢查入口管線是否有氣泡 溶劑瓶?jī)?nèi)過(guò)濾頭阻塞，更換或清潔濾頭 與檢測(cè)器有關(guān)的故障及其排除v1）流動(dòng)池內(nèi)有氣）流動(dòng)池內(nèi)有氣v基線上出現(xiàn)許多線狀“峰”，v這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)也可能使噪音增大，v2）流動(dòng)池被污染）流動(dòng)池被污染v無(wú)論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移。

13、v可以使用適當(dāng)溶劑清洗檢測(cè)池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用磷酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。v3）光源燈出現(xiàn)故障）光源燈出現(xiàn)故障v紫外或熒光檢測(cè)器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時(shí)需要更換光源燈。v4）倒峰）倒峰v檢測(cè)器的極性接反了，v用示差折光檢測(cè)器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于流動(dòng)相的折光指數(shù)，也會(huì)出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動(dòng)相。v紫外檢測(cè)器，如果流動(dòng)相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，無(wú)吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相。v在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓

14、力變化，或者由于樣品溶劑與流動(dòng)相不同所引起的 氣泡引起的問(wèn)題氣泡引起的問(wèn)題 v色譜峰保留時(shí)間、面積改變 溶劑瓶?jī)?nèi)氣泡產(chǎn)生，引起輸液不良 泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，引起輸液不良 氣泡引起的問(wèn)題氣泡引起的問(wèn)題 色譜峰變形v色譜峰變形色譜柱內(nèi)氣泡產(chǎn)生、滯留 引起峰變形氣泡引起的問(wèn)題氣泡引起的問(wèn)題 噪聲v針狀、鋸齒狀噪聲峰流通池內(nèi)氣泡產(chǎn)生、滯留 引起基線噪聲 氣泡引起的問(wèn)題氣泡引起的問(wèn)題 基線波動(dòng)大v紫外檢測(cè)器基線波動(dòng)大 氣泡存在，其中氧溶解量過(guò) 多造成檢測(cè)不良 紫外、熒光、示差折光檢測(cè) 器 保留時(shí)間漂移保留時(shí)間漂移 系統(tǒng)有漏 流速變化 柱穩(wěn)變化（或室穩(wěn)變化），確認(rèn) 柱溫箱溫度 不正確的梯度洗脫程序 色譜柱的固定相已發(fā)生改變 樣品流出色譜柱后，再生時(shí)間 不足（柱后衍生）溫度的影響v柱子的恒溫精度要求在0.10.5之間，v不同的檢測(cè)器對(duì)溫度的敏感度不