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1、背景學(xué)問(wèn):細(xì)胞培育的傳代及日常維持過(guò)程中,在培育器具、培育液及各種預(yù)備工作方面都需大量的耗費(fèi),而且細(xì)胞一旦離開活體開頭原代培育,它的各種生物特性都將漸漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此準(zhǔn)時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存格外必要。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,試驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多接受甘油或二甲基亞砜(DMSO)作愛護(hù)劑,這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,削減細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而削減由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)接受快速溶化的方法,這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即溶化,避開由于緩慢
2、溶化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。細(xì)胞凍存操作步驟: 1. 配制含6-10%DMSO的10%小牛血清的凍存培育液,冰上預(yù)冷; 2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái),懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管; 3. 離心500rpm,5min; 4. 去除胰蛋白酶及舊的培育液,由慢至快,滴入配制好的凍存培育液,用吸管輕柔吹打使細(xì)胞均勻(在冰上進(jìn)行);一般一個(gè)小方瓶?jī)鲆恢Щ蛘咭粋€(gè)10cm培育皿凍2支。 5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中,每管1ml(若凍存多于1支,則每支要均勻分裝); 6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,凍存時(shí)間及操作者; 7. 凍存:放入裝有異丙
3、醇的程序降溫盒中,-70冰箱中放3天左右,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。留意事項(xiàng): 1從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培育細(xì)胞都可以用于凍存,但最好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培育液; 2將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí),要做好防護(hù)工作,以免凍傷; 3凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培育液。細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟:1. 從液氮容器中取出凍存管,快速浸入37溫水中,并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快溶化; 2. 當(dāng)最終一小塊冰快溶化時(shí),將凍存管放在冰浴上。 3. 用吸管吸出細(xì)胞懸液,由慢至快滴入已經(jīng)加10倍以上凍存液的培育皿中,輕輕混勻; 4. 其次天,換培育液或者3. 用吸管吸出細(xì)胞懸液,由慢至快滴入已經(jīng)加10
4、倍以上凍存液的離心管中,輕輕混勻;離心, 500rpm,5min; 4. 棄去上清液,加培育液吹勻,轉(zhuǎn)至培育皿。留意事項(xiàng):1. 取細(xì)胞的過(guò)程中留意帶好防凍手套,護(hù)目鏡。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮,解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升,可導(dǎo)致爆炸。2. 凍存液的問(wèn)題:凍存液的配置已是常識(shí),在這里不作詳述,但二甲基亞砜(DMSO)對(duì)細(xì)胞不是完全無(wú)毒副作用,在常溫下,二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞的毒副作較大,因此,必需在1-2min內(nèi)使凍存液完全溶化。假如復(fù)蘇溫度太慢,會(huì)造成細(xì)胞的損傷,二甲基亞砜(DMSO)最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。3. 離心前須加入少量培育液。細(xì)胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,留意加入少量培育液可稀釋其濃度,以削減
5、對(duì)細(xì)胞的損傷。4. 離心問(wèn)題:目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培育瓶中進(jìn)行培育,其次天換液。由于離心的目的是兩個(gè),去除DMSO,去除死細(xì)胞,這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程,但對(duì)一般人來(lái)說(shuō),把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間,轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少,細(xì)胞就全被扔掉了,轉(zhuǎn)過(guò)了活細(xì)胞會(huì)受壓過(guò)大,死亡。此外在操作過(guò)程中簡(jiǎn)潔污染,所以不推舉。另一種說(shuō)法為細(xì)胞懸液中含有二甲基亞砜(DMSO),DMSO對(duì)細(xì)胞有肯定的毒副作用,所以須將離心后的液體前倒凈,且肯定倒?jié)崈?。在試?yàn)中依據(jù)常規(guī)的離心分裝的方法進(jìn)行復(fù)蘇,結(jié)果無(wú)特別。5. 細(xì)胞貼壁少的問(wèn)題:教科書中說(shuō)明凍存細(xì)胞解凍時(shí)1ml細(xì)胞液要加10ml15m培育液,而閱歷總結(jié)為培育基越少細(xì)胞越簡(jiǎn)潔貼附。6. 復(fù)蘇細(xì)胞分裝的問(wèn)題:試驗(yàn)中的閱歷總結(jié)為復(fù)蘇1管細(xì)胞一般可分裝到1-2只培育瓶中,分裝過(guò)多,細(xì)胞濃度過(guò)低,不利于細(xì)胞的貼壁。7. 加培育基的量放入問(wèn)題:這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度,從假如你加培育基的太少,那么DMSO的濃度就會(huì)比較大,就會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng),從以前的資料來(lái)看,DM
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