樹突狀細胞疫苗在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

1、樹突狀細胞疫苗在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀潘春華綜述羅榮城審校(第一軍醫(yī)大學附屬南方醫(yī)院腫瘤科,廣州510515中國圖書分類號R73013文獻標識碼A文章編號10002484X(20031020732204樹突狀細胞(Dendritic Cells,DC是目前所知的功能最強的、也是唯一能激活初始性T細胞(Native T cell的專職抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cell, APC,具有強大的激活C D8+CT L及C D4+T輔助細胞的能力,控制著體內(nèi)免疫反應(yīng)的過程,在免疫應(yīng)答中處于中心地位,因而成為腫瘤免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。DC可以在體外培養(yǎng)后用于體內(nèi)免疫治療,也可輔

2、以細胞因子或其它因子如Flt23等在體內(nèi)擴增1。用DC疫苗進行抗腫瘤治療已受到重視2,3,且成為當今腫瘤生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點課題,對樹突狀細胞疫苗的研究日趨深入而廣泛。1樹突狀細胞及其生物學特征DC最初是Steinman和C ohn等1973年從小鼠的脾組織中分離發(fā)現(xiàn)的,因其形態(tài)具有樹突樣或偽足樣突起而命名。DC細胞種類繁多,但其共同特征是,具有典型的樹突狀形態(tài)、膜表面高表達MHC2類分子及C D80+、C D86+等共刺激分子、活化C D4+及C D8+T淋巴細胞、刺激雛型T淋巴細胞增殖活化、誘導(dǎo)特產(chǎn)生異樣CT L及免疫應(yīng)答。在外周血中含量約為白細胞總數(shù)的1%,分為髓系DC和淋巴系DC

3、兩大類,主要來自髓系。非成熟DC參與抗原的攝取、加工和處理,而成熟的DC則參與抗原的遞呈及活化T細胞,提呈抗原能力是巨噬細胞和B細胞的1001000倍,是體內(nèi)唯一的職業(yè)抗原提呈細胞。來自血液的雛形淋巴細胞經(jīng)過內(nèi)皮細胞微靜脈進入淋巴組織,DC、濾泡型DC、B細胞及T淋巴細胞共同聚集在濾泡區(qū)的生發(fā)中心參與抗體形成。之后經(jīng)輸出淋巴管進入T細胞聚集區(qū),最后死亡。類漿細胞亞群DC從血液直接進入T細胞區(qū),其生命周期仍不清楚(圖14。DC疫苗有一些特化作用,抗原捕獲、MHC復(fù)合體的形成及T細胞刺激作用。DC表達多種受體,其天然配體仍未探知,因此,抗受體的抗體常用作替代作者簡介:潘春華(1968年-,女,博士

4、研究生,主治醫(yī)師,從事腫瘤生物治療及基因治療的研究;指導(dǎo)教師:羅榮城(1958年-,男,碩士,博士生導(dǎo)師,主任醫(yī)師,從事腫瘤生物治療及基因治療的研究。抗原。幾種受體是型跨膜蛋白,具有單一的外部C型植物凝血素區(qū)。FcR介導(dǎo)提呈MHC2類抗原的外源途徑。DC還表達高水平的選擇性T LRs,從而當受微生物刺激后成熟。在成熟的過程中,DC產(chǎn)生并表達高水平的共刺激分子以促進T細胞增殖分化(圖24。透射電鏡下可見DC伸展的突起,胞漿中富含線粒體,溶酶體較少。在掃描電鏡下可見胞體突起形成不規(guī)則形態(tài),細胞表面微絨毛消失,表面粗糙,層疊狀雛襞明顯。樹突狀突起粗、長,易觀察(圖3。2DC的來源及體外培養(yǎng)由于自體免

5、疫細胞與異體樹突狀細胞之間由于存在著人類白細胞抗原(H LA,如果基因型不相合會引起強烈的排斥反應(yīng),且受體內(nèi)的T細胞不能識別供者樹突狀細胞上非匹配的H LA分子,無法誘導(dǎo)有效的CT L的增殖及抗腫瘤作用,因而必須是自體的樹突狀細胞才能作為腫瘤疫苗的負載體用于臨床抗腫瘤治療。目前用作瘤苗的樹突狀細胞來源有:骨髓、外周血和新生兒臍帶血。3DC疫苗的種類目前,DC介導(dǎo)的疫苗主要有三大類:腫瘤抗原肽修飾的DC;細胞性腫瘤抗原修飾的DC;腫瘤抗原及細胞因子基因轉(zhuǎn)染的DC,具體研究及應(yīng)用將在各具體疾病中詳細討論,現(xiàn)僅概述如下 。圖1樹突細胞和淋巴細胞的循環(huán)Fig.1DC circulations and

6、lymphocyte 圖2樹突細胞捕獲抗原、形成MH C 多胎復(fù)合物和刺激T 細胞的特化作用Fig.2Some specializations of DCs for vaccine capture ,MH C 2peptide complex form ation ,and T cellstimulation 圖3掃描電鏡下觀察到的DC 細胞的形態(tài)(×5000Fig.3Morphology of DC observed by electron microscopy(×5000311腫瘤抗原肽修飾的DC 動物模型及人體臨床試驗已證明,腫瘤抗原肽(包括合成肽或腫瘤細胞相關(guān)抗原與

7、自身或同種異體的DC 共育,DC 與腫瘤表位肽結(jié)合之后可激發(fā)抗腫瘤CT L 有效的抗腫瘤免疫,將DC 回輸給機體,可預(yù)防腫瘤播散、復(fù)發(fā)及治療腫瘤?？捎米髁雒绲目乖挠心[瘤抗原、分化抗原、腫瘤獨特型抗體、癌基因及抑癌基因產(chǎn)物、粘蛋白等。用負載腫瘤表位肽的DC 免疫小鼠,可使具有同表位肽的腫瘤消退及抵抗致死劑量腫瘤細胞的攻擊。與此同時,該類腫瘤的其它表位肽亦受攻擊,這種現(xiàn)象稱為表位擴展(epitope spreading 。德國學者用負載Her2neu75肽或M UC1M1肽的DC 疫苗治療乳腺癌和卵巢癌5,在10例中有5例體內(nèi)檢測到了肽特異性CT L ,且持續(xù)6個月以上,1例病人經(jīng)幾次M UC1

8、肽DC 疫苗免疫后,檢測到了CE A 和M AGE 3肽特性T 細胞反應(yīng),另1例病人用Her2neu75肽DC 疫苗治療7次后,檢測到了M UC1肽特異性T 細胞反應(yīng),預(yù)示用單一抗原成功免疫后在體內(nèi)也可出現(xiàn)抗原的擴展,這一結(jié)果對今后應(yīng)用其它肽DC 疫苗治療腫瘤有一定的指導(dǎo)作用。另外,應(yīng)用腫瘤抗原MHC 2類多肽沖擊樹突狀細胞,可提高腫瘤抗原濃度及其靶向性。利用弱酸洗脫法可獲得腫瘤細胞表面的MHC 2類抗原肽,試用于臨床也收到較好療效6。朱學軍等用該法提取的腫瘤抗原肽致敏DC 治療荷瘤小鼠也取得了較好的療效7。由于弱酸可以洗脫絕大部分腫瘤細胞表面與MHC 2類分子結(jié)合的多肽,對于那些MHC 2類

9、分子表達陽性的腫瘤,提供了一個較好的腫瘤抗原肽的來源,有希望用于臨床。G abrilovich 等用突變的P53多肽致敏DC 而制備的DC 疫苗可延長攜帶人突變P53基因的荷瘤小鼠的生存時間8。腫瘤抗原肽致敏的DC 疫苗雖有上述優(yōu)點,但也存在如下不足之處:難以確定最佳刺激劑量、抗原成分復(fù)雜、含有自身正常抗原、易誘發(fā)自身免性疾病等危險。312細胞性腫瘤抗原修飾的DC 由于目前腫瘤特異性抗原或相關(guān)性抗原得到明確鑒定的為數(shù)甚少,因而予以瘤細胞全部抗原信息(如腫瘤細胞裂解物、腫瘤細胞提取物、腫瘤細胞的總RNA 或經(jīng)過滅活的完整的腫瘤細胞修飾DC 成為必要?；诩毎阅[瘤抗原易于獲取和制備,因而應(yīng)用全細

10、胞性腫瘤抗原沖擊致敏DC 的方法來制備DC 疫苗不失為一種簡便而有實效的方法,有較大的臨床應(yīng)用潛力。近年來,有人用腫瘤細胞與DC 融合的方法制備DC 疫苗。范國昌等用人樹突狀細胞與人白血病細胞K 562融合誘導(dǎo)出P210蛋白特異性的CT 9。由此提示,腫瘤細胞與DC 融合是制備DC 疫苗的又一方法。不足之處:所需要的瘤細胞數(shù)量多;非相關(guān)抗原量大且種類多,易誘發(fā)自身免疫病;所用的抗原多肽不一定能誘導(dǎo)最佳的抗腫瘤免疫反應(yīng),如因抗原調(diào)變、抗原脫失或抗原的低免疫原性等原因;刺激劑量難以確定。313腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗基于DC的基因疫苗有:轉(zhuǎn)染腫瘤抗原的RNA的DC疫苗、轉(zhuǎn)染腫瘤抗原DNA的DC疫

11、苗以及轉(zhuǎn)染細胞因子基因的DC疫苗等。由于大部分腫瘤患者的瘤細胞的抗原的基因信息以及編碼的抗原不明確,或缺乏足夠的瘤組織而無法用抗原肽負載DC的方法制備DC瘤苗,而使患者失去治療機會10。分子生物學的發(fā)展使核酸擴增成為可能,腫瘤抗原RNA或相應(yīng)的cD2 NA文庫為腫瘤抗原的來源提供了方法。通過核酸擴增、差異篩選等方法獲得足夠的腫瘤細胞特異性mRNA,從而解決疫苗制備時腫瘤細胞來源困難及其特異性問題,避免誘發(fā)自身免疫性疾病的危險。同時經(jīng)基因轉(zhuǎn)染樹突狀細胞可持續(xù)表達腫瘤抗原,避免了前兩種疫苗因抗原解離或降解而影響其功能的不足。Nair等發(fā)現(xiàn)用編碼CE A抗原的RNA轉(zhuǎn)染的人DC在體外能誘發(fā)強而有力的

12、CT L反應(yīng)11。但是目前這種技術(shù)尚不很成熟。盡管基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果令人鼓舞,但基于花費高及缺乏方便性,其商業(yè)可行性值得考慮,安全性更是不容忽視的問題。因而針對上述要求,脂質(zhì)體聯(lián)合組織特異性基因表達系統(tǒng)似乎可以滿足條件12。曹雪濤等還將重組腺病毒介導(dǎo)的G M2CSF基因轉(zhuǎn)染樹突狀細胞,并經(jīng)腫瘤抗原沖擊致敏后與腫瘤細胞融合,制備出免疫原性更強的新型瘤苗以及用淋巴細胞趨化因子基因修飾的樹突狀細胞均誘導(dǎo)出特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答13。Nikitina等認為約50%的人類惡性腫瘤存在基因突變或野生型P53,其過表達產(chǎn)生腫瘤表位14。用腺病毒介導(dǎo)野生型P53基因轉(zhuǎn)染DC,并用該DC 刺激T淋巴細胞(T淋巴細胞來

13、自9例H LA2A2+的癌癥患者,3例H LA2A2+的健康人,觀察到該DC 對P53過表達的H LA2A2+的瘤細胞有強的細胞毒作用,而對P53非表達的瘤細胞及H LA2A2陰性瘤細胞卻無細胞毒作用,該作用具有特異性并由C D8+CT Ls介導(dǎo),說明野生型P53轉(zhuǎn)染DC可誘導(dǎo)特異性的抗腫瘤免疫。Ishida等也研究了用腺病毒介導(dǎo)野生型P53基因轉(zhuǎn)染DC,發(fā)現(xiàn)DC感染腺病毒48小時后轉(zhuǎn)染率可達50%,轉(zhuǎn)染后的DC可有效誘導(dǎo)活化特異性的CT L,用其免疫表達人突變型P53基因的小鼠,85%可產(chǎn)生完全性免疫保護15。Ranieri等用重組腺病毒載體AdEG FP(可編碼一種強化的綠色熒光蛋白EG

14、FP轉(zhuǎn)染DC,使其表達E B病毒抗原(如潛在膜蛋白2B,LMP2B,并與E B 病毒血清學陽性的健康供者的H LA2A2+的CT L共育,95%的DC于48小時后可檢測到綠色熒光蛋白(EG FP的表達,Ad LMP2轉(zhuǎn)染的DC用來激活C D8+ T細胞,觀察針對LMP23292337肽的T淋巴細胞反應(yīng),第14天與第0天相比,從01003上升至013 (P<01001,第21天后可以觀察到針對自體E B病毒2B淋巴細胞瘤系細胞的特異性細胞溶解反應(yīng)16,提示E B病毒抗原基因轉(zhuǎn)染DC可用于E B病毒相關(guān)腫瘤的免疫治療,如鼻咽癌。另外,為其它與病毒感染有關(guān)的腫瘤的免疫治療提供借鑒。如上所述,D

15、C疫苗在腫瘤免疫治療中具有諸多優(yōu)勢,但還有許多亟待解決的問題:DC體外培養(yǎng)條件的規(guī)范化,如:細胞因子的種類、配伍及最佳的劑量組合等,因有些細胞因子的作用復(fù)雜,尚需明確;器皿的選擇;培養(yǎng)基的成分須進一步明確與統(tǒng)一,做到有效、合理、經(jīng)濟的搭配。目前,各實驗室所用培養(yǎng)基各異,如RPMI1640、I M DM等等,以使DC 活性得以最好的發(fā)揮;培養(yǎng)時血清的使用問題,如用何種血清,人血清、小牛血清、胎牛血清,還是不用血清,血清中抗體是否影響DC抗原位點及其活性的發(fā)揮;可被DC有效提呈的腫瘤抗原及其RNA、DNA的認識及獲取,運用確實能夠誘導(dǎo)出具有殺傷活性的CT L的抗原或基因來刺激或轉(zhuǎn)導(dǎo)DC;成熟程度的

16、控制,由于非成熟DC的抗原攝取能力強,而成熟DC的抗原提呈能力強,前者誘發(fā)免疫耐受,后者誘發(fā)免疫應(yīng)答,DC的成熟發(fā)程度被看作是DC疫苗發(fā)揮功效的平臺4;制備DC基因疫苗所用的載體問題,即:轉(zhuǎn)運的高效性、對DC活性的影響、對機體無或盡可能少的毒副作用等,目前,DC疫苗所用的載體有:脂質(zhì)體、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒等。相信,經(jīng)過不斷的探索與實踐,DC疫苗會在腫瘤免疫治療領(lǐng)域發(fā)揮出應(yīng)有的作用。4參考文獻1Berz ofsky J A,Jeffrey D.S trategies for designing and optimizing new gen2 eration vaccinesJ.Natu

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