估及抗藥性菌株的分子檢測(cè)技術(shù)研究

1、碩士學(xué)位論文估及抗藥性菌株的分子檢測(cè)技術(shù)研究 中文摘要 Cea Rostr 為靶標(biāo) 本研究以專性寄生菌黃瓜霜霉瘸菌 挑d夠e"DnD!ppr口cubensisq臥rket 菌，探討其不同發(fā)商階段對(duì)烯肟菌精的敏感性，確定了烯肟菌酪辯黃瓜耩霉病菌的毒力涮定方法， 并建立了黃瓜霜霉精菌對(duì)烯肟藍(lán)酯的敏感基線；進(jìn)行了該病原菌對(duì)烯肟越酯的室內(nèi)抗性飆險(xiǎn)評(píng)估及 田問抗藥性檢測(cè)；研究了黃瓜霜霉瘸菌對(duì)烯肟菌酯產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)制，由藏建立了抗藥性隨株 的分子檢測(cè)方法。獲褥以卜m研究結(jié)皋： 1黃瓜霜霉病菌不同發(fā)育階段對(duì)烯肟菌酯的敏感性結(jié)果說明，烯肟菌酯對(duì)黃瓜霜霉病菌的休Ir 穩(wěn)蘸發(fā)沒鴦季犖翻籜稿，霹熒淹震

2、霉瘸蓮瓣游動(dòng)手蓬予釋茲、游秀孢子游動(dòng)、芽營(yíng) 棗長(zhǎng)、裝旌擴(kuò)展、氌 子囊梗形成、孢子囊產(chǎn)生均有抑制作用，而且對(duì)黃瓜霜霉病菌的孢子囊釋放、游動(dòng)孢子游動(dòng)和芽管 律長(zhǎng)有顯著f 孽捧翻傳臻。蒸手藥翻辯蘸簍壘茨舂靜隸?終嗣，對(duì)體| 德靜翡發(fā)沒存影璃，并綜會(huì)考慮 試驗(yàn)方法的可操作性和穩(wěn)定、準(zhǔn)確性，推襻使用葉碟保濕法測(cè)定烯肟菌酪對(duì)菌絲擴(kuò)展的EC50以建 立霜攆病菌澍烯耪藤酯靜敏感基線。 2扶北京、天溥、內(nèi)蒙古、湖l等來使爿I過烯黔藏醞鞠嗣類恭螢剎的黃瓜栽培她采撰52株黃 瓜耩霉病菌，采用葉碟保濕法測(cè)定艇對(duì)烯肟菌酯的敏感性。緒果說明，EC分布于 性頻率分布星連續(xù)單峰曲線，接近正態(tài)分布，尚未出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性群

3、體，蹶此可以采剛供 試蓬株豹平均ECso作為黃瓜霾霉薅藩對(duì)爝輯藿醍瓣敏感鏊線，勢(shì)蠲予翻閼抗藥蠛箍測(cè)。 3室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)儲(chǔ)說明，采用紫外誘變和藥劑馴化的方法誘導(dǎo)均可獲得抗烯腑省酯的突變 體，EC島分布子10-5omml，抗瓣性指數(shù)為80-502倍。其中紫井誘交方法較翡翔戮德方法更赫 獲得抗藥性突變體，且其抗性水平高于藥劑馴化方法。局部生物學(xué)性狀研究顯示，突變體的抗藥性 狀穩(wěn)定，其致病力、適合魔恭 競(jìng)爭(zhēng)力與親本敏感菌株相比沒有明擻差異或優(yōu)予紊本菌株。烯肟藩酯 與脯譴菌酯之間存在正交互抗藥性，與氟嗎啉、耩脲氰和甲霜靈之間均光交互抗藥性。綜合分析表 明，黃瓜霜霉病菌對(duì)烯肟釃酯具有較高的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，在

4、| l間自然情況卜抗藥性菌株可能形成優(yōu)勢(shì) 菌群，建議生產(chǎn)上斑格烯黔越酯與其它無(wú)!蹙互抗性的藥劑交替使用或混合使圳，以防止或延緩抗勢(shì) 性的產(chǎn)生。 4+密闋撥藥性整羲l試駿表銹，隧著撬棼次數(shù)鵑增魏，筵豫霸霉病蘸對(duì)烯囂藏酪茲域繕性貉囂下 降，試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)兩株低抗藥性德株，抗性倍數(shù)分別為476、384。 5病原菌抗藥性分子桃制研究結(jié)果說明，與敏感菌株線粒體曲藻因局部氨基酸序列眈對(duì)， Fnu4Hl的酶切位點(diǎn)。進(jìn)一步通過生物信息舉技術(shù)分析了藥荊靶標(biāo)位點(diǎn)01蜘基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果說明L77 靼All3均幣在燎瓣蘊(yùn)蘸麓結(jié)合區(qū)域愨，霹蛙這舞個(gè)氫基酸靜突變也沒毒驥Cytb基因綾會(huì)霹域嬲結(jié) 構(gòu)發(fā)生明顯的變化，因此推測(cè)黃

5、瓜耩霉病菌線粒體中Cytb基因的143位氨基酸的突變是靶標(biāo)菌對(duì)烯 舞藏穗產(chǎn)生羧蛙的主要原丞。 6建立了抗藥性菌株的分子檢測(cè)方法。采用ASPCR和CAPS方法進(jìn)行抗藥餓菌株的檢測(cè)，可 獲得與傳統(tǒng)擻物測(cè)定方法相同的檢測(cè)結(jié)果。與傳統(tǒng)方法相比，分子檢測(cè)方法可緇綴檢測(cè)時(shí)間、提高 檢測(cè)效率，因此可作為田間抗性菌櫧早期診斷的理想方法。 關(guān)鍵詞：爝粒薅穗，黃瓜霜霉病藤，竣感基線，抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，挽藥性分子機(jī)制，分子檢測(cè) l Abstract Theeffectofenostrobilurinonthedifferent inthelife of stages cyclePseudoperonospora deve

6、lopment cubensiswasstudied，TheresultsshowedthatenostrobilurinhadUOeffecton eystosporegermination，but the release tube zoospore elongation，hypha preventedzoospore motility,germ fromstomataand ofenostrebilurinto release emergency sporangialformationThe丑 value zoospore and tube was made germ elongation

7、 zoospore breakdownat andinhibited fromstomata 005#gml obviouslyhyphagrowth，sporangiophOreemergency and formation at spomngial obviously5,ugm1 The andHubaiin2003 determinednvLtrothek曩fdiscs baseline Innermongolia and2005，were by assay髓e to sensitivities as from to witha ECs0 00030ugmL enostrobihirin

8、，expressedvalues，ranged 0031399mk ThesensitivitiesofallisolatesdistributedasaunimodelCurveandno mealof 00101±00031 ugmL resistant baseline wassuitableforfieldresistance subpopulationappearedThus,thissensitivity monitoring The riskof曼c(diǎn)ubensistoenostrobilurinwasassessedinthis laboratoD"resis

9、tance paper騷n enostrobilurin-resistantmutantswereobtained andUV-irradiation throughfungi西deadaptation method， with and levelof values from t0 highfrequencyhigh resistance，whichECso ranged12馳gmL361mmL andresistancefactorswere80-502Furthermorethemutantsinduced UVwere levelof easilyby higher resistance

10、than thoseselected characteristicsofmutantsindicatedthatthe byadaptionSomebiological and ofthe were enostrobiinrin-rasistantmutantsnot pathogenicity,fitnesscompetition significantly differentfromthatoftheir髓rentalstminsTheresistantlevelofenostrobilurin-resistantmutantswasstable afterlOdiseaseon leav

11、eswithoutenostrobilurinDataalsoshowedthattherewasa cycleshealthy positive CROSSresistancebetweenenostrobilufinand notwith azoxystrobin，but studiesrevealedthatenostrobilurinwasa risk laboratory high fungicideTherefore，the epidemic oftheresistant ofPcubensiswouldbe infieldItWaS thatthe development pop

12、ulation possible suggested enostrobilurin shouldbealternatedormixturedUsewithother whichhavenotcross-resistantto fungicides avoidor the ofresistance， delaydevelopment Twolow resistancestrainsweremonitoredinthefieldtreated withenostrobilurintwelvetimesa year A mutationWas sindepoint L77Mfoundinlowres

13、istancestrainsfromthefieldandtwo sindepoint mutations All3G，G143Awerefouudinallmutantsfromthe evaluationThe G143A laboratory sequence lnlheresistancestrainscouldbe Fnu4HI recognized bioinfotmaticsshowedthe by Although analysis domain wasassociatedwith of釃of置cubensis strobilurin，u7andAll3werenot inth

14、e present domain?Thedidnot theconstructionof change change amutationat the咖pocketThisstudysuggested 143wasa reasonforlhe of position major strobflurinresistanceinthe rapiddevelopment mutants high H Inthe theAS-PCRandCAPSwere todetectG143Amutationandtheresultsofthetwo study developed were to methodss

15、imilartraditional methodcostedless methodsHowever,molecular biological biology timethantTaditional methods biological risk to sensitivity,resistancefungicide， resistance detectionnthod mechanism,molecular biology P938411 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲瞻所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。 盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他入已經(jīng)發(fā)表

16、或撰 鬻過豹研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書面使用過 的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何奉獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并 表示了謝意。 研究生簽名：圣老 時(shí)間：名胗多年月Fj 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保存送 交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手 段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué) 位論文的全部或局部?jī)?nèi)容。 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 研究生簽名：每當(dāng) 時(shí)問：夕緲年彳月IH 挪簽名：卟咱 時(shí)間：彳年月礦

17、一 第一章前言 11病原菌抗藥性的研究現(xiàn)狀 自19世紀(jì)中葉巴斯德建立了病原學(xué)理論，提高人類對(duì)病害防治的自覺性：1882年法國(guó)波爾 多大學(xué)Millardet發(fā)現(xiàn)波爾多液能防治葡萄霜霉病的作用，開創(chuàng)了人類有意識(shí)合成無(wú)機(jī)和保護(hù)性殺 菌劑防治植物病害歷史。兒個(gè)世紀(jì)以米，化學(xué)防治在植物病害的綜合治理中一直占據(jù)著重要地位， 發(fā)揮了巨大的作削。20世紀(jì)60年代中期以前，用于植物病害防治的藥劑主要為一些非選擇性， 多作用靶點(diǎn)的保護(hù)性殺菌劑，如取代苯基類的百菌清、雙二硫代氨基甲酸酯類的代森錳鋅及些 銅制劑等“譜型保護(hù)性殺菌劑，病原菌不易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，因此抗藥性的問題并未引起人類的 關(guān)注。自上個(gè)世紀(jì)70年代以來

18、，隨著植物癇害化學(xué)防治丁作的開展，內(nèi)吸性殺菌劑因其顯著的 生物活性和優(yōu)異的內(nèi)吸傳導(dǎo)性曾得到廣泛和頻繁地應(yīng)用，使植物病害的防治取得了劃時(shí)代的進(jìn) 展。但由丁-該類殺菌劑作用位點(diǎn)單一，病原菌易產(chǎn)生抗藥性，而且抗性水平會(huì)隨著藥劑的選擇壓 力的提高而不斷提高，最終可能直接導(dǎo)致化學(xué)防治的失敗。由于在新藥劑的使用初期，人類對(duì)抗 藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估未給予足夠的重視，忽略了抗藥性檢測(cè)和治理措施，致使病原菌的抗藥性問題不斷 顯現(xiàn)利日趨嚴(yán)重。其中最具代表性的殺菌劑為苯酰胺類藥劑甲霜靈，1977年商品化，1980年在 23年后，即形成了抗藥病原群體，并隨著使用年代 霜霉病，馬鈴薯晚疫病等卵菌病害，但使_ ； j 的延續(xù)和施

19、藥次數(shù)頻繁，藥劑防病效果逐漸降低甚至防治失敗，目前在大局部地區(qū)的抗藥性菌株 頻率超過50，局部地區(qū)抗藥性水平高達(dá)萬(wàn)倍以上 李煒，1998：畢朝位，2002 ?，F(xiàn)己報(bào)道有 多種植物病原菌分別對(duì)甾醇生物合成抑制劑、二甲酰弧胺類殺菌劑、氨基嘧啶類殺菌劑、苯并咪 唑類殺菌劑、黑色素合成抑制劑和甲氧丙烯酸酯類殺菌劑產(chǎn)生了較高水平的抗藥性。 伴隨著病原菌抗藥性問題的發(fā)牛，開展和目趨嚴(yán)霞，人們逐漸認(rèn)識(shí)到了對(duì)殺菌劑進(jìn)行抗藥性 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、抗藥陛監(jiān)測(cè)和治理的必要性。1981年國(guó)際農(nóng)藥J：業(yè)協(xié)會(huì)成立了殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì) ResistanceAction FRAC，F(xiàn)ungicide Committee ，開辟了植

20、物病理學(xué)和植物化學(xué)保護(hù)學(xué)新的研究 領(lǐng)域。目前FRAC已經(jīng)成立了甾醇生物合成抑制劑、二甲酰亞胺類、苯并咪唑類、苯胺嘧啶類、 苯基酰胺類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑抗性工作組03rentKJ，1998 。殺菌劑抗藥性研究在國(guó)際上 也受到，。泛重視。目前在歐美新藥劑申請(qǐng)產(chǎn)品登記時(shí)，必須提供有關(guān)產(chǎn)品的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)分析報(bào)告 及相應(yīng)的抗藥性治理策略，修訂的EPPO 歐洲和地中海植物保護(hù)組織 指導(dǎo)方針中也進(jìn)一步詳 述了殺菌劑抗藥性文本要求。國(guó)外一。些人的農(nóng)藥公司在開發(fā)新農(nóng)藥的同時(shí)，投入大量的科研經(jīng)費(fèi) _I j丁研究新藥劑的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)和抗藥性機(jī)制，建立抗藥性檢測(cè)技術(shù)及合理的抗藥性治理策略，在 一種新產(chǎn)品推向市場(chǎng)的同

21、時(shí)，基r抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和抗藥性機(jī)制的研究，檢測(cè)技術(shù)和抗藥性防治 策略也同時(shí)推出。而我國(guó)在這一研究領(lǐng)域還處_非常落后的狀況，國(guó)內(nèi)從事農(nóng)藥抗藥性研究的單 位很少，在抗藥性方面的研究大多是針對(duì)已產(chǎn)生的抗藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)和治理，而對(duì)于一種新藥在大 面積推廣之前進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)和抗性機(jī)制研究?jī)汉鯖]有。國(guó)家有關(guān)新農(nóng)藥刨制研發(fā)中也鮮有對(duì)丁抗 藥性風(fēng)險(xiǎn)研究的專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)支持，尤其在殺菌劑抗藥性研究方面更為突出。這種情況極大地影響了 我國(guó)創(chuàng)制產(chǎn)品的國(guó)際認(rèn)知度和市場(chǎng)潛力，同時(shí)由于國(guó)內(nèi)殺菌劑的實(shí)際應(yīng)用較抗藥性研究更為超 前，導(dǎo)致投入巨資創(chuàng)制的新型藥劑可能面臨抗藥性產(chǎn)生，使用壽命縮短等巨大的風(fēng)險(xiǎn)。 12病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 “植

22、物病原物抗藥性是指對(duì)殺菌劑敏感的野生型植物病原物個(gè)體或群體，由于遺傳變異出現(xiàn) 普遍的接受，即田問的抗藥性突變是一個(gè)自發(fā)的過程，但突變的原因不是因殺菌劑的誘變，突變 一般發(fā)生在殺菌劑使用之前，殺菌劑僅起到了一個(gè)選擇的作用，殺死了敏感個(gè)體，使抗性個(gè)體得 以表現(xiàn)出來。因此在田間是否會(huì)發(fā)生抗藥性和抗性水平問題，主要取決于“殺菌劑病原物組 合本身的內(nèi)在因子，包括殺菌劑的作用機(jī)制和作用特點(diǎn)，病原菌群體中潛在的抗藥性基因，抗藥 性遺傳學(xué)特征和適合度等。 植物病原物對(duì)殺菌劑的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)由根本風(fēng)險(xiǎn)和治理風(fēng)險(xiǎn)組成。根本抗藥性風(fēng)險(xiǎn)由病害和藥 劑決定，滿足F列條件之一意味著具有抗藥性風(fēng)險(xiǎn)： 1 藥劑作用位點(diǎn)單一： 2

23、 與現(xiàn)用藥劑之 間有交互抗性關(guān)系； 3 藥劑殺菌活性高、持效期長(zhǎng)形成很高的選擇壓力； 4 抗藥性由單基因 突變控制； 5 病菌繁殖周期短、產(chǎn)孢量大、擴(kuò)散速度緩慢；突變處理、藥劑選擇、有性雜交獲 得適合度蚶的抗藥菌株； 6 發(fā)病條件適宜 王英華，2003 。 一般殺菌劑使用之前或之初可根據(jù)人工誘變、藥劑選擇或馴化試驗(yàn)、田問敏感鹵株敏感性變 異、抗藥性菌株的生物學(xué)及遺傳學(xué)特征、殺菌劑作用方式等進(jìn)行根本抗藥性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)；實(shí)驗(yàn)室抗 藥性研究是新農(nóng)藥應(yīng)用前評(píng)估抗藥性產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。通常情況下病原物群體中存在著 10410。10的單基因抗藥性突變頻率，如果通過在室內(nèi)誘變和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等處理可以大大提高突變頻

24、 率，獲得抗藥性菌株。依據(jù)抗藥性類型、抗藥性開展速度、藥劑之間的交互抗性關(guān)系、抗藥基因 類型、基因數(shù)和對(duì)致病力的影響，抗、敏基因的相對(duì)適合度等內(nèi)容研究評(píng)估農(nóng)藥抗性風(fēng)險(xiǎn)。殺菌 劑使用數(shù)年之后，可根據(jù)人工誘變、藥劑選擇或馴化、田問藥效與抗藥性發(fā)生、抗藥性菌株的生 物及遺傳特征、殺菌劑作_ lj方式與使用對(duì)策等資料，并結(jié)合已有的根本抗藥性風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行 抗藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 Brent，1999 。目前人們通常采用初步探測(cè)、早期評(píng)估、回憶分析、分類評(píng)估等 13病原菌產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制研究 131病原菌抗藥性的生化機(jī)制 目前已有多類殺菌劑抗藥性機(jī)理研究說明，降低親和性是病原物產(chǎn)生抗藥性最重要的生化機(jī) 制。病原

25、物只要發(fā)生單基閉或少數(shù)寡基岡突變就可以導(dǎo)致病原物靶標(biāo)位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的改變，而降低對(duì) ?；郧鷦┑挠H和性。雖然病原物一般不會(huì)同時(shí)發(fā)生多基因的變異而降低與多作用靶點(diǎn)化合物的 親和性，但是生理生化代謝可以發(fā)生某種變化，修飾細(xì)胞壁或生物膜的結(jié)構(gòu)，阻止藥劑到達(dá)作用 靶點(diǎn)，或者減少對(duì)藥劑的吸收，或者增加排泄，減少藥劑在細(xì)胞內(nèi)的積累等表現(xiàn)抗藥性。真菌對(duì) 苯酰胺類、羧酰替苯胺類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性就是分別在相應(yīng)的作片J靶點(diǎn)mRNA聚合酶和琥珀酸 輔酶Q復(fù)原酶復(fù)合體發(fā)生構(gòu)象改變，降低了藥劑與這些靶點(diǎn)的親和性而表現(xiàn)抗藥性。創(chuàng)制殺菌劑 抗藥性的研究可以從這些研究方法和結(jié)果中得以借鑒。 l-32病原菌抗藥性的分子機(jī)制 隨著分子

26、生物學(xué)技術(shù)的開展及在病原菌抗藥性機(jī)制研究方面的應(yīng)用，多種病原菌的抗藥性分 子機(jī)制已經(jīng)明確。目前報(bào)道病原菌對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性的機(jī)制主要是藥劑作用的靶標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突 變，即靶標(biāo)位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，藥劑與靶標(biāo)位點(diǎn)的結(jié)合能力下降。不同的病原菌抗性菌株 靶標(biāo)位點(diǎn)突變位點(diǎn)不同，而且同一種病原菌不同抗藥性水平菌株突變位點(diǎn)也可能不同。下面介紹 病原菌對(duì)幾類殺菌劑產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制。1 病原苗對(duì)苯并咪唑類殺菌劑fMBC 抗性機(jī)制。蘋 Jones，AL 果黑星病菌 Venturiainaequalisl koenraadt,Hand Luck JE，GillingsMR，1995 和油菜菌核病菌 Sclerot

27、inia 7002 等多種病原菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑 MBC 抗性機(jī)制是病原苗的B微管蛋白基因發(fā)生革堿 基突變，使藥劑與病原菌的B微管蛋白的親和力下降，藥劑無(wú)法與作用位點(diǎn)結(jié)合，即不能發(fā)揮殺 由Phe TrC 突變?yōu)? TAC LuckJE，1995 。1998年Gareth 對(duì)苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性是B微管蛋白的50位氨基酸發(fā)生突變由1W突變?yōu)镃ys Gareth H報(bào)道 致病菌Penicillium 的靶標(biāo)位點(diǎn)P“。的過量表達(dá)。抗性菌株中編碼P。50的PdCYPSl基因的啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子 有多個(gè)重復(fù)單元，導(dǎo)致了P450的過量表達(dá)，殺菌劑的作用效果降低，致使病原菌對(duì)該藥劑產(chǎn)生抗 性 H

28、iroshi P450氧化酶的CYP51發(fā)生點(diǎn)突變 Liannis 脫氫抑制劑 MBID 抗性機(jī)制。2004年Haruko Sawada報(bào)道稻瘟菌 Magnaporthegrisea 對(duì) 變，75位氨基酸由Val突變?yōu)镸et Haruko Sawada，2004 。4 許多病原菌對(duì)甲氧丙烯酸酯類 殺菌劑 001 抗性機(jī)制。病原菌對(duì)甲氧丙烯酸酯類殺菌劑 ooI 產(chǎn)生抗藥性主要是由丁病原菌的線 目前已報(bào)道細(xì)胞色素b基因中共有11個(gè)抗藥性突變位點(diǎn) 張舒亞，2002 。 133病原菌對(duì)strobilurins抗性發(fā)生和開展情況及抗藥性機(jī)制 蟊 甲氧丙烯酸酯類殺菌劑由丁作朋位點(diǎn)單一，且作用靶標(biāo)白發(fā)突變頻

29、率高，在藥劑的高選擇壓 力r病原菌容易產(chǎn)生抗藥性群體。室內(nèi)抗藥性研究說明，這類殺菌劑具有中等抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。但是， 該類殺菌劑1996年在歐洲開始用于小麥白粉病的防治，1998年在德國(guó)北部三個(gè)地區(qū)檢測(cè)到抗性 個(gè)體，抗性倍數(shù) 500。1999年，在德國(guó)的其它地區(qū)及法國(guó)、比利時(shí)、英國(guó)和丹麥也檢測(cè)到了抗性 菌株。1999年Ishii等報(bào)道在日本監(jiān)測(cè)到黃瓜硐I甜瓜上的門粉病蔭和霜霉病菌的抗藥性群體。田 I可抗性開展情況與室內(nèi)預(yù)測(cè)不相符合。國(guó)際殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì) FIu屺 于1997年成立了 QDl殺菌劑活性與抗性工作組 STAR ，經(jīng)過科學(xué)的研究分析說明，該類殺菌劑具有高抗藥性風(fēng) 險(xiǎn)，并制定了該類殺菌劑

30、的治理方針和推薦使用守那么 張舒亞，2002 。 表11對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的病原菌 Pathogen 觸Host G刪eogra怖phica。挪eofI押 resi型sta。篆：“。 c1甜1 如tribu“on Alternariaalterna衄 Alternaria US G143A 1，2 tenussima,Pistachio Alternariaarborescens Alternariamall Apple US G143A 3 Alternariasolani Potato US F129L 4 Blumeria ginis8ptriticf Whtd EU G

31、143A Barlcv 5 andhordei Colletotrichum US G143A 6 graminlcolaTurfgrass cassiicola Cucumber Japan G143A Corynespora Didymellabryoniae Cucuthit US G143A f81 Glomerella strawberries G143A f9 cingulata Japan CentralandSouth Banana G143A Mycosphaerellafijiensis America，ameoon， 10 Philippines Mycosphaerel

32、lagraminicolaWheat EU GJ43A 1112 nattrassii G143A 13 Mycobellosiella Eggplant Japan viticola EU G143AandF129L 14 Plasmopara Grape cubensis Cucurbits EU，Asia G143A 05，16 Pseudoperonospora Pyrenopho。 Barlcvandwheat EU F129L 17 P tritici?repentis US G143Aand PyriculariagriseaTuffgrass F129L 1819 Pythiu

33、maphanidermammTurfgrass US F129L 20 Cuanrbits EU，Asia G143A 21，22 Spearotheca且liginea 墜坐坐!：型!i： 生也! ；! Q!墜 l：!? 國(guó)外有關(guān)甲氧丙烯酸酯類殺菌劑抗藥性分子機(jī)制的研究說明，多數(shù)病原菌對(duì)strobilurins產(chǎn)生 抗藥性是由丁線粒體出基因氨基酸143位發(fā)生點(diǎn)突變，由甘氨酸變成了丙氨酸 G143A 。氨 基酸的改變導(dǎo)致。出基因結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化，使藥荊不能與其結(jié)合，降低了藥劑與靶標(biāo)之間的 的求年¨力。病原兇的線粒體cy曲基網(wǎng)氨基酸143何發(fā)生點(diǎn)突變后，病原曲的致病力和適合度并 沒有發(fā)

34、生明顯的變化，在田間很容易成為優(yōu)勢(shì)群體 NicholasF，2004 。但是有些病原真菌氨基 酸的突變位點(diǎn)不是在143位，例如瓜果腐霉菌和稻瘟菌，抗藥性的產(chǎn)生是由于線粒體出基因 氨摹酸129位發(fā)生突變，即F129L由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼帷蝹€(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變的機(jī)率比擬大，兩 個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生突變的機(jī)率較小。經(jīng)人鼉研究證明抗性突變體發(fā)生突變的區(qū)域主要集中在 4 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章前言 氨基酸127147位發(fā)生突變，表現(xiàn)高水平的抗藥性。Ishii等人的試驗(yàn)研究說明黃瓜霜霉病菌和 向粉病菌對(duì)腈嘧菌酯 商品名：阿米西達(dá) 產(chǎn)生抗藥性的主要原因就是Cytb基因的G143A發(fā)生 報(bào)道現(xiàn)已在世界不

35、同地區(qū)的檢測(cè)到18種病原菌對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的菌株， 井己明確其抗性機(jī)制 表11 。 14病原菌抗藥性檢測(cè)方法 常規(guī)病原菌抗藥性檢測(cè)方法有以一FJb種，菌落生長(zhǎng)測(cè)定法、菌絲干重測(cè)定法、孢子萌芽測(cè)定 法、孢子產(chǎn)生營(yíng)測(cè)定法、瓊脂展布法、抑菌圈測(cè)定法、葉盤漂浮測(cè)定法。菌落生長(zhǎng)和菌絲干重測(cè) 定法能準(zhǔn)確反映殺菌劑對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用；孢子萌芽測(cè)定法適于測(cè)定容易產(chǎn)生孢子的真菌和 對(duì)孢子萌發(fā)有抑制作用的殺菌劑；孢子產(chǎn)生量測(cè)定法和葉盤漂浮測(cè)定法對(duì)專性寄生菌適用，如小 麥銹病和黃瓜霜霉病菌 慕立義，1991 。這些方法都需要通過測(cè)定藥劑對(duì)病原菌的Ec50來比擬 敏感和抗性菌株的差異，試驗(yàn)需要多個(gè)

36、處理，屢次重復(fù)。檢測(cè)周期長(zhǎng)、T作量大、消耗的人力資 源和材料較多。而且上述常規(guī)方法檢測(cè)靈敏度低，抗藥性菌株的突變頻率在l以上才能被檢測(cè) 到。由于病原菌的繁殖、傳播速度一般都很快，在自然界存在的數(shù)量又很大，岡此經(jīng)過幾次藥劑 選擇后，抗約性病原皤群體可能會(huì)成為致病病原群體中的主體，造成病害大流行。 病原茵的生理生化性質(zhì)的改變，會(huì)導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生，所以目前也可廊用生理生化方法檢測(cè) 抗藥性菌株，分析不同抗藥性水平病原菌中某一特定的酶或蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，比擬 抗藥性菌株與敏感菌株的差異，檢測(cè)抗藥性菌株。目前已有報(bào)道，比擬分析核盤菌不同水平抗藥 性菌株之間可溶性蛋白和酯酶的電泳圖譜，檢測(cè)核盤菌對(duì)

37、速克靈抗藥性菌株 李新風(fēng)，2003 。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)飛速開展及應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，分子技術(shù)開始在病原菌抗藥性檢測(cè)中的 應(yīng)用，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比擬，不但節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間、提高了J一作效率，而乩提高了檢測(cè)的靈敏 皮，檢測(cè)頻率在1010。，更適_ j于檢測(cè)低頻率抗藥基因，因此也被作為田間抗性早期診斷的理 想方法。本章主要介紹病原菌抗藥性分子檢測(cè)及監(jiān)測(cè)方法。 141病原菌抗藥性SNP檢測(cè)系統(tǒng) 病原菌產(chǎn)生抗藥性的主要原因是殺菌劑作用位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，用檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性方法檢 測(cè)病原菌抗藥性菌株，簡(jiǎn)稱SNP檢測(cè)系統(tǒng)。SNP檢測(cè)系統(tǒng)中最直接的方法就是利用生物信息學(xué) 從已有的基岡信息庫(kù)中搜尋基因序列，通過基

38、因序列的比對(duì)尋找單核苷酸的多態(tài)性。但是這種方 法要求基岡序列，所以廊用的局限性較大。此外，最常用的SNP檢測(cè)方法還有許多種，這些 方法根據(jù)其原理可分為以FJL種類型，1 基于PCR以及酶切的方法，如突變特異性擴(kuò)增 ARMS 、 PCR-RFLP、RAPD及real-time quantitativePCR等；2 基于雜交的方法，主要包括等位基因特異 寡核苻酸片段分析 Alelle-special Oligonucleotide，ASO 、基因芯片技術(shù) GeneClips ；ffl毛細(xì)血管電 泳 Capillary 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章前言 GradientGel GradientG

39、el Electrophoresis, Electrophresis,TGGEl、變性梯度凝膠電泳 Denaturing StrandConformation DC,GE 、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 Single Performanc2 技術(shù) DcnatudngHigh Liquid 用比擬高 歐陽(yáng)建華，2003 。在殺菌劑抗藥性研究領(lǐng)域中，目前報(bào)道用于檢測(cè)單堿基突變的抗 藥性菌株的方法主要有以下幾種： mutation 1411突變特異性擴(kuò)增 amplWwafionrefractory system,ARMS 突變特異性擴(kuò)增 ARMS ，直譯放大受阻突變體系，又稱為等位特異性PCR Allele SpecificPCRASPCR 。其根本原理是，在一對(duì)引物之一的3端設(shè)計(jì)一個(gè)堿基與突變堿基配對(duì)， 這樣此引物由予3端與正常DNA不配對(duì)而在PCR反響中不能延伸，突變的DNA那么可以延伸。因而 可將一段正常DNA與該段突變DNA 分開。此方法具有快速、簡(jiǎn)便、非放射性等特點(diǎn)，得到廣泛應(yīng) 用。在此根底上，針對(duì)不同點(diǎn)突變可設(shè)計(jì)多個(gè)錯(cuò)配引物，在一個(gè)反響體系中進(jìn)行PCR反響，即多 allelespecific 重等位基因特