微生物限度-直接接種方法以及菌落計(jì)數(shù)

1、菌落總數(shù)百科名片菌落總數(shù)就是指在一定條件下（如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等） 每克（每毫升）檢樣所生長(zhǎng)出來的細(xì)菌菌落總數(shù)。按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧情況下，37C培養(yǎng)48h,能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要 求的以及非嗜中溫的細(xì)菌， 由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求， 故難以繁殖生長(zhǎng)。 因此菌落 總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)， 菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類， 所以有時(shí)被稱 為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。目錄菌落總數(shù)介紹 檢驗(yàn)方法說明（一）樣品的處理和稀釋：（二）傾注培養(yǎng)（三）計(jì)數(shù)和報(bào)告菌落總數(shù)介紹菌落是指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖而形成的

2、能被肉眼識(shí)別的生長(zhǎng)物，它是由數(shù)以萬計(jì)相同的細(xì)菌集合而成。 當(dāng)樣品被稀釋到一定程度，與培養(yǎng)基混合，在一定培養(yǎng)條件下，每 個(gè)能夠生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌細(xì)胞都可以在平板上形成一個(gè)可見的菌落。菌落總數(shù)測(cè)定是用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量， 它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求， 以 便對(duì)被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)。 菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的 優(yōu)劣。檢驗(yàn)方法菌落總數(shù)的測(cè)定，一般將被檢樣品制成幾個(gè)不同的 10 倍遞增稀釋液，然后從每個(gè)稀釋 液中分別取出 1mL 置于滅菌平皿中與營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時(shí)間 后（一般為 48 小時(shí)），記錄每個(gè)平皿中形成的菌落數(shù)量，

3、依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每克（或每 ml）原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)?；静僮饕话惆ǎ簶悠返南♂寖A注平皿培養(yǎng) 48小時(shí)計(jì)數(shù)報(bào)告。國(guó)內(nèi)外菌落總數(shù)測(cè)定方法基本一致，從檢樣處理、 稀釋、傾注平皿到計(jì)數(shù)報(bào)告無何明顯不同，只是在某些具體要求方面稍有差別，如有的國(guó)家在樣品稀釋和傾注培養(yǎng)進(jìn)， 對(duì)吸管內(nèi)液體的流速， 稀釋液的振蕩幅度、 時(shí)間和次數(shù)以及放置時(shí)間等 均作了比較具體的規(guī)定。檢驗(yàn)方法參見：GB4789.2-94 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定SN0168-92 中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品菌落計(jì)數(shù) 說明（一）樣品的處理和稀釋：1.操作方法：以無菌操作取檢樣2

4、5g （或25ml），放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1： 10 的 均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后， 最好置滅菌均質(zhì)器中 以800010000r/min的速度處理1min，制成1: 10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1: 10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試 管混合均勻，制成 1： 100 的稀釋液。另取 1ml 滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序，制 10 倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用 1 支 1ml 滅菌吸管。2.無菌操作：操作中必須有“無菌操作” 的

5、概念， 所用玻璃器皿必須是完全滅菌的， 不得殘留有細(xì)菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用 75% 乙醇在包裝開口 處擦拭后取樣。 操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工 作臺(tái)暴露 15分鐘，每個(gè)平板不得超過 15 個(gè)菌落。 3采樣的代表性：如系固體樣品， 取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)， 宜多采幾個(gè)部位。 固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨， 液體樣品須經(jīng)過振 搖，以獲得均勻稀釋液。4樣品稀釋誤差： 為減少樣品稀釋誤差， 在連續(xù)遞次稀釋時(shí)，每一稀釋液應(yīng)充分振搖，使其均勻，同時(shí)每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管。 在進(jìn)行連續(xù)稀 釋時(shí)， 應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿管壁流入， 勿

6、使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)， 以免吸管外部粘附的檢液 溶于其內(nèi)。 為減少稀釋誤差， SN 標(biāo)準(zhǔn)采用取 10mL 稀釋液，注入 90mL 緩沖液中。 5稀釋液： 樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水， 有的采用磷酸鹽緩沖液（或 0.1蛋白胨水） ， 后者對(duì)食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。 如對(duì)含鹽量較高的食品 （如醬油） 進(jìn)行 稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。（二）傾注培養(yǎng)1操作方法：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)，選擇23 個(gè)適宜稀釋度，分別在制10 倍遞增稀釋的同時(shí)，以吸取該稀釋度的吸管移取 1ml 稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度 做兩個(gè)平皿。將涼至46C營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，

7、混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有 1ml 稀釋液（不含樣品） 的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36 ± 1C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 ± 2h,取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。2 傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在 46 C水浴內(nèi)保溫， 溫度過高會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應(yīng) 以皮膚感受較熱而不燙為宜。傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一， 從 1220ml 不等，一般以 15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底 部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。3 為使菌落能在

8、平板上均勻分布，檢液加入平皿后， 應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻， 可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)， 檢樣從開始稀釋到傾注最 后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。4 培養(yǎng)溫度一般為37C（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30C）。培養(yǎng)時(shí)間一般為48h,有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計(jì)數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度， 瓊脂平板培養(yǎng)48h 后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15%。5 為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4 C環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察。在某些場(chǎng)合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清

9、，可在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC）,培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。注意事項(xiàng)：（ 1 ）操作要快而準(zhǔn)，包括材料、加樣、倒培養(yǎng)基。（ 2）吸液體時(shí)液體不能進(jìn)入吸頭。（ 3）樣品稀釋時(shí)一定要混勻。（4）倒培養(yǎng)基前， 瓶口要過火焰。（ 5）一定要有空白對(duì)照。（ 6）培養(yǎng)基溫度控制，培養(yǎng)基薄厚。（ 7）檢測(cè)時(shí)一定要使平皿完全暴露于空氣中。（三）計(jì)數(shù)和報(bào)告1 操作方法：培養(yǎng)到時(shí)間后，計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的菌落數(shù)。可用肉眼觀察，必要時(shí)用放 大鏡檢查， 以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計(jì) 算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進(jìn)行報(bào)告。2到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。

10、如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0 4 C,但不得超過24h。3.計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)選取菌落數(shù)在 30300 之間的平板（ SN 標(biāo)準(zhǔn)要求為 25250 個(gè)菌落），若有二個(gè)稀釋度均 在 30300之間時(shí)，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2 取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報(bào)告）。4若所有稀釋度均不在計(jì)數(shù)區(qū)間。如均大于 300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告 之。如均小于 30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告之。如菌落數(shù)有的大于 300，有的又小于 30 ，但均不在 30300 之間，則應(yīng)以最接近 300 或 30 的平均菌落數(shù)

11、乘以稀釋倍 數(shù)報(bào)告之。 如所有稀釋度均無菌落生長(zhǎng)， 則應(yīng)按小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 有的規(guī)定 對(duì)上述幾種情況計(jì)算出的菌落數(shù)按估算值報(bào)告。5不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。 如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象， 則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò) （有的食品有時(shí)可能出現(xiàn)逆 反現(xiàn)象，如酸性飲料等） ，不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。6當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)， 如呈鏈狀生長(zhǎng)的菌落之間無任何明顯界限， 則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)， 如存在有幾條不同 來源的鏈， 則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算， 不要把鏈上生長(zhǎng)的每一個(gè)菌落分開計(jì)數(shù)。 如有片 狀菌落生長(zhǎng)，該平板一般不宜采用， 如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻， 則可 以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘 2 代表全平板的菌落數(shù)。 7當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多 （即所 有稀釋度均大于 300 時(shí)），但分布很均勻，可取平板的一半或 1/4 計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。8菌落數(shù)的報(bào)告，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1100 時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)