六味地黃湯對(duì)糖皮質(zhì)激素腎陰虛模型免疫器官淋巴細(xì)胞凋亡的抑制作用(Ⅱ)

1、    六味地黃湯對(duì)糖皮質(zhì)激素腎陰虛模型免疫器官 淋巴細(xì)胞凋亡的抑制作用()          摘要：為進(jìn)一步探討腎陰虛證在免疫學(xué)上的實(shí)質(zhì)，隨機(jī)將 30 只 NIH 小鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和六味地黃湯組，給藥 6 d 后處死動(dòng)物，以原位末端標(biāo)記法檢測(cè)脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘區(qū)域的 T 淋巴細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組動(dòng)脈周圍淋巴鞘少有 T 淋巴細(xì)胞凋亡，模型組動(dòng)脈周圍淋巴鞘見較多 T 淋巴細(xì)胞凋亡，而六味地黃湯組動(dòng)脈周圍淋巴鞘 T 淋巴細(xì)胞凋亡數(shù)明顯

2、低于模型組(P0.05)。提示滋陰補(bǔ)腎中藥六味地黃湯有拮抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)脾 T 淋巴細(xì)胞凋亡的作用。反證了腎陰虛證存在脾 T 淋巴細(xì)胞凋亡的情況，而滋補(bǔ)腎陰藥物對(duì)其有抑制作用。主題詞：腎陰虛/免疫學(xué)；六味地黃湯/藥理學(xué)；脾/病理學(xué)；T 淋巴細(xì)胞/藥物作用；脫噬作用/藥物作用中分類號(hào)：R318.15；R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3213(2000)03-0207-02Inhibitory Effect of Liuwei Dihuang Decoction on Lymphocyte Apoptosis in Immune Organ of Glucocorticoid-ind

3、ucedKidney-yin-deficiency Animal Model()XU Qin，DU Biaoyan，LUO Hui，SU Junfang，WU Shaofeng（Dept. of Pathology, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China）Abstract: To further explore the immunological mechanism of kidney-yin-deficiency syndrome, NIH mice were allocated to three groups: norma

4、l control group, model group and Liuwei Dihuang Decoction (LDD) group. Apoptotic T lymphocyte in lymphatic sheath around splenic artery was detected with in situ end labeling technique after medication for 6 days. The results showed that the number of apoptotic T lymphocytes was more in the model gr

5、oup than that in the normal group, and much less in LDD group than that in the model group (P0.05). This indicates that LDD with the action of nourishing Yin and tonifying kidney can antagonize T lymphocyte apoptosis induced by glucocorticoid.Key words: KIDNEY-YIN DEFICIENCY/immunol.;LIUWEI DIHUANG

6、DECOCTION/pharmacol.;SPLEEN/pathology;T-LYMPHOCYTES/drug eff.;APOPTOSIS/drug eff.六味地黃湯是滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典古方，以往的實(shí)驗(yàn)證明，六味地黃湯對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的 NIH小鼠胸腺萎縮有拮抗作用1。細(xì)胞免疫缺陷現(xiàn)象既發(fā)生在嬰幼兒和青少年，也可發(fā)生在成年人，而青春期后胸腺逐漸萎縮，細(xì)胞免疫功能由周圍免疫器官行使。為了解六味地黃湯對(duì)周圍免疫器官細(xì)胞免疫功能的影響，并進(jìn)一步探討腎陰虛證的實(shí)質(zhì)，我們?cè)谙嗤瑒?dòng)物模型的基礎(chǔ)上，對(duì)脾淋巴細(xì)胞凋亡進(jìn)行了檢測(cè)、分析。1材料與方法1.1動(dòng)物NIH小鼠，雄性，體重1822g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所

7、提供。1.2藥物氫化可的松注射液(揚(yáng)州制藥廠)，20mL/支，批號(hào)：980403。六味地黃湯由熟地黃24g、山茱萸12g、淮山藥12g、澤瀉9g、茯苓9g、牡丹皮9g組成。藥材由本校第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)本校中藥鑒定教研室鑒定。將上述中藥材置陶器內(nèi)加水1L浸泡1h后煎煮1h，將再次藥液混合濃縮至75mL(每mL含生藥1g)，用雙層紗布過濾后置4冰箱保存?zhèn)溆谩?.3分組及給藥將小鼠分為3組，每組10只。正常對(duì)照組：每天肌注生理鹽水0.04mL，灌胃飲用水0.5mL，共6d。模型對(duì)照組：每天肌注氫化可的松0.04mL(5g/L)，灌胃飲用水0.5mL，共6d，造成腎陰虛模型。六味地黃湯組：同模

8、型組造模，并每天灌六味地黃湯0.5mL(1kg/L)，共6d。1.4病理檢察給藥結(jié)束后處死小鼠，完整取下脾臟，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5m切片，常規(guī)HE染色，生物顯微鏡下觀察。1.5脾組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用原位末端核苷標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由德國(guó)寶靈曼公司提供。步驟如下：(1)5m切片；(2)二甲苯，10min；(3)二甲苯，10min；(4)95%酒精，10min；(5)95%酒精，10min；(6)80%酒精，10min；(7)雙蒸水稍洗；(8)PBS洗5min×2次；(9)0.01mol/LSSC微波，10min；(10)3%H2O2，

9、37，10min；(11)PBS洗5min×3次；(12)末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶50L加入550L熒光素標(biāo)記的核苷酸混合液，37，2h；(13)PBS洗5min×3次；(14)過氧辣根酶標(biāo)記的羊抗熒光素抗體，37，30min；(15)PBS洗5min×3次；(16)DAB顯色10min；(17)蘇木素復(fù)染；(18)返蘭，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。OlympusBX40生物顯微鏡下觀察。    1各組脾動(dòng)脈周圍淋巴鞘T淋巴細(xì)胞凋亡狀況a.正常組；b.模型組；c.六味地黃湯組2結(jié)果2.1一般形態(tài)觀察各組脾臟紅髓、脾小體均

10、見細(xì)胞凋亡，并見散在多核巨細(xì)胞凋亡，考慮可能為巨噬細(xì)胞。但在動(dòng)脈周圍淋巴鞘區(qū)域(T淋巴細(xì)胞集聚區(qū))，正常組細(xì)胞凋亡較少見，模型組見較多淋巴細(xì)胞凋亡。結(jié)果見封底本文1。2.2動(dòng)脈周圍淋巴鞘凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)在動(dòng)脈周圍淋巴鞘附近切片每張片隨機(jī)取2個(gè)高倍視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)，結(jié)果見表1。組別N/只N凋亡細(xì)胞/(個(gè).視野-1)正常對(duì)照組99.44±4.54模型對(duì)照組1087.61±76.61*六味地黃湯組833.43±14.66     統(tǒng)計(jì)方法：t檢驗(yàn)；*與正常組比較P0.001；與模型組比較P0.05 3討論六味地黃丸(湯)是經(jīng)典的滋

11、陰補(bǔ)腎古方，出自小兒藥證直訣，由熟地、山茱萸、淮山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮6味中藥組成3?，F(xiàn)代研究表明，腎陰虛證多伴有腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)和糖皮質(zhì)激素水平升高，故以過量的糖皮質(zhì)激素制備腎陰虛動(dòng)物模型是目前醫(yī)學(xué)界比較公認(rèn)的方法2。這種糖皮質(zhì)激素水平的升高必然影響機(jī)體的免疫功能。在青春期之前，糖皮質(zhì)激素水平的升高既可以影響中樞免疫器官胸腺，又可影響周圍免疫器官。青春期以后，由于胸腺逐漸萎縮，這種糖皮質(zhì)激素水平的升高，應(yīng)主要影響周圍免疫器官。有實(shí)驗(yàn)顯示，糖皮質(zhì)激素水平的升高可引起胸腺的萎縮，其機(jī)制為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)了胸腺細(xì)胞的凋亡4，5。而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步顯示，六味地黃湯(丸)可拮抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的脾動(dòng)

12、脈周圍淋巴鞘區(qū)域T淋巴細(xì)胞的凋亡。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能提示，對(duì)于成人繼發(fā)性T細(xì)胞免疫缺陷癥，以六味地黃湯(丸)為主進(jìn)行滋陰補(bǔ)腎治療，有一定的臨床應(yīng)用前景。基金項(xiàng)目：廣東省中醫(yī)藥管理局課題(NO.97072)作者簡(jiǎn)介：徐勤(1963-)，男，講師徐勤（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）杜標(biāo)炎（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）羅惠（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）蘇俊芳（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）吳紹鋒（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）參考文獻(xiàn)：1杜標(biāo)炎，徐勤，羅惠，等.六味地黃湯抗糖皮質(zhì)激素所致小鼠胸腺萎縮的病理學(xué)研究J.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，16(2)：1112陳小野.脾虛和腎虛動(dòng)物模型的研究思路J.中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1988，3(1)：643許濟(jì)群，王綿之，許子建，等.方劑學(xué)M.上海：上?？萍汲霭嫔?，1993.1044馬春樹，姜敘誠(chéng)，