四逆散、歸脾湯與溫膽湯對慢性應激肝郁模型大鼠行為學的影響

1、四逆散、歸脾湯與溫膽湯對慢性應激肝郁模型大鼠行為學的影響        【摘要】  【目的】觀察疏肝方四逆散、養(yǎng)血健脾方歸脾湯和理氣化痰方溫膽湯對慢性應激肝郁模型大鼠行為學的影響，以進一步探討該模型的中醫(yī)證候性質?！痉椒ā窟x用SD大鼠40只，按10g/L蔗糖水攝取率分層隨機分為5組，即正常對照組、模型組、四逆散組（劑量為56g·kg-1·d-1）、歸脾湯組（劑量為196g·kg-1·d-1）、溫膽湯組（劑量為805g·kg-1·d-1）；采用慢性

2、應激刺激方法復制肝郁證模型，觀察各組大鼠體質量、血清皮質酮含量、10g/L蔗糖水攝取率和強迫游泳中靜止時間。【結果】模型組大鼠血清皮質酮含量升高、蔗糖水攝取率降低、強迫游泳中靜止時間延長,與正常對照組比較差異均有顯著性意義（P005或P001）；四逆散組可降低血清皮質酮含量、升高蔗糖水攝取率，縮短強迫游泳中靜止時間，與模型組比較差異均有顯著性意義（P005或P001）；歸脾湯組、溫膽湯組各檢測指標均無顯著性改變（P005），各組大鼠體質量增加量比較均無顯著性差異（P005）?！窘Y論】本研究的慢性應激大鼠模型屬肝郁證模型，與心脾兩虛及痰熱內擾證無關。 【關鍵詞】  慢性應激/中藥療法；

3、肝郁證/中藥療法；四逆散/應用；歸脾湯/治療應用；溫膽湯/治療應用；疾病模型，動物；大鼠Abstract:  ObjectiveTo observe the effects of Sini Powder (SP)，Guipi Decoction (GD) and Wendan Decoction (WD)，which have the actions of soothing liver，nourishing blood and strengthening spleen，and regulating Qi and resolving phlegm respectively，on the

4、 behavior of rat models with liverQi stagnation induced by chronic stress，and to explore the essence of traditional Chinese medical syndrome of this model.MethodsForty male SpragueDawley rats were exposed to an unpredictable sequence of mild stressors for 21 days while being treated by SP (56 g·

5、;kg-1·d-1)，GD (196 g·kg-1·d-1) or WD (805 g·kg-1·d-1).According to the intake rate of 10g/L sucrose solution，the rats were divided into normal control group，model group，SP group，GD group and WD group by stratified randomization.Body weight，standing time during forced swimmin

6、g test and intake rate of 10g/L sucrose solution were investigated during the whole procedure.Serum corticosterone content was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA).Results In the model group，serum corticosterone content was increased，intake rate of sucrose solution was reduced，and st

7、anding time during forced swimming test was prolonged (P005 or P001 compared with those in the normal control group).SP counteracted the above changes in the mode group (P<005 or P<001)，but GD and WD had no effect on the above indexes (P>005).The difference of body weight increase was insig

8、nificant between the 5 groups (P005).Conclusion The rat model of liverQi stagnation can be induced by chronic stress，which is different from the syndromes of deficiency of both heart and spleen and the interior disturbance of phlegmheat.Key words:  CHRONIC STRESS/TCD therapy;STAGNATION OF LIVER

9、QI/TCD therapy;SINI POWDER /therapeutic use;GUIPI DECOCTION/therapeutic use;WENDAN DECOCTION/therapeutic use;DISEASE MODELS，ANIMAL;RATS證候是中醫(yī)學研究的關鍵問題之一。由于影響證候的因素復雜、范圍廣泛以及倫等方面因素的制約，使證候發(fā)生機理的研究很難深入，建立證候動物模型是擺脫這一困境的重要途徑。肝郁證是臨床常見的基礎性證候，已有用CCl4注射、艾葉注射或夾尾急性激怒法、模具限制法等多種制作肝郁證動物模型的報道1，但這些造模方法均因有種種缺陷，近年已很少應用。為了

10、更好地模擬臨床肝郁證，我們采用慢性應激的方法初步建立了肝郁證大鼠模型2，并從臨床發(fā)病學特點、核心癥狀和3種治法代表方劑的治療效應等方面，分析了該模型的合理性，初步認為其證候性質屬肝郁且與脾虛無關3-4。在上述工作的基礎上，本研究擬比較疏肝方四逆散、養(yǎng)血健脾方歸脾湯和理氣化痰方溫膽湯對該模型大鼠的行為學效應，以進一步探討該模型的中醫(yī)證候性質?，F(xiàn)報道如下。1材料與方法11藥物、試劑及儀器按照方劑學5確定方劑的組成，其中四逆散（傷寒論）：柴胡6g，枳實6g，生白芍6g，炙甘草6g；歸脾湯（濟生方）：白術9g，茯苓9g，黃芪12g，龍眼肉12g，炒酸棗仁12g，人參6g，木香6g，炙甘草3g，當歸9g

11、，遠志6g；溫膽湯（三因極一病證方論）：半夏6g，竹茹6g，枳實6g，橘皮9g，炙甘草3g，茯苓45g。以上各方用飲用水將中藥免煎顆粒（首創(chuàng)大地藥業(yè)有限公司）按成人（以60kg計）1日用量的14倍配制成懸濁液，其中四逆散濃度為056g/mL，歸脾湯濃度為196g/mL，溫膽湯濃度為0805g/mL。蔗糖（C12H22O11，分子量為34229）購自北京化學試劑公司；皮質酮酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒（批號：24110603）購自美國R&D公司。HY2調速多用振蕩器購自江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠。12動物、分組及給藥雄性SD大鼠40只（SPF級），體質量190210g，由北京

12、維通利華實驗動物公司提供，許可證號：SCXK（京）20020003；正常光照條件，自由攝取食水，馴養(yǎng)1周并進行10g/L蔗糖水攝取訓練。禁水24h后，于第2天清晨89時測定1h的10g/L蔗糖水攝取量，攝取率，隨后采用區(qū)組隨機設計的方法，按10g/L蔗糖水攝取率劃分區(qū)組，再按隨機數(shù)字表法隨機分為5組，每組8只。正常對照組群養(yǎng)，每天灌胃飲用水10mL/kg；慢性應激模型組（簡稱模型組）孤養(yǎng)，每天灌胃飲用水10mL/kg，并按程序施加造模刺激；慢性應激加四逆散組（簡稱四逆散組）每天灌胃劑量為56g/kg的四逆散懸濁液，并按程序施加造模刺激；慢性應激加歸脾湯組（簡稱歸脾湯組）：每天灌胃劑量為196g

13、/kg的歸脾湯懸濁液，并按程序施加造模刺激；慢性應激加溫膽湯組（簡稱溫膽湯組）：每天灌胃劑量為805g/kg的溫膽湯懸濁液，并按程序施加造模刺激。普通飼料與飲用水在允許時可自由攝取。各組處理時間均為21d，每3d測定1次大鼠體質量，以調整灌胃藥量。13造模方法2刺激方法包括：夾尾1min，水平振蕩160次/min共30min，4冰水游泳5min，禁水24h，禁食24h，晝夜顛倒24h，45熱環(huán)境5min。上述刺激每天1種，每種刺激各3次，隨機安排，使動物不能預知次日的刺激。14血清皮質酮測定于末次刺激后次日，斷頭取血，4放置3h后，4離心15min（4000g），分離血清，-40保存?zhèn)錅y。檢測

14、方法按試劑盒說明書操作。15蔗糖水攝取率測定根據6的方法操作。在正式實驗前，先對大鼠進行蔗糖水攝取訓練，即先用10g/L蔗糖水和飲用水同時喂養(yǎng)48h，然后斷水24h，于次日清晨89時再次同時給予大鼠自由飲用10g/L蔗糖水和飲用水共1h，分別記錄攝取量，根據下列公式計算蔗糖水攝取率（p攝?。?，并在實驗的第7、14、21天各重復測量1次。p攝取=V蔗糖水（V蔗糖水+V飲用水）×100%16強迫游泳中靜止時間測定根據文獻7的方法進行。于末次應激24h后，先進行適應性強迫游泳15min，即將大鼠放入內徑20cm、高60cm的圓形透明玻璃缸中，缸中加溫度（25±1）的溫水，深約25

15、cm，使大鼠在水中不能以后爪支撐身體、前爪攀附于缸壁，取出后用毛巾擦干放回籠中。每缸水僅使用1只大鼠。24h后再同樣將大鼠放入水中，累計記錄5min內大鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)的時間。每只大鼠僅進行1次實驗，由兩人同時觀察記錄，取平均值作為各大鼠強迫游泳靜止時間的數(shù)據。17統(tǒng)計學方法采用SPSS130統(tǒng)計軟件包進行隨機區(qū)組設計的方差分析，組間兩兩比較的SNKq檢驗。2結果21各組大鼠體質量及血清皮質酮的變化表1結果顯示，各組大鼠體質量均有增加，但增加量差異無顯著性意義（P005）。模型組大鼠血清皮質酮含量顯著升高，與正常對照組比較差異有顯著性意義(P001)。四逆散組大鼠血清皮質酮含量顯著

16、低于模型組（P005），與正常對照組比較差異無顯著性意義（P005）。歸脾湯組、溫膽湯組與模型組比較差異均無顯著性意義（P005）。表1各組大鼠體質量增加量及血清皮質酮的變化比較（略）1         22各組大鼠蔗糖水攝取率變化表2結果顯示，模型組大鼠蔗糖水攝取率顯著降低，與正常對照組比較差異有顯著性意義（P005）；四逆散組攝取率升高，與模型組比較差異有顯著性意義 (P005)；歸脾湯組、溫膽湯組攝取率與模型組比較差異均無顯著性意義（P005）。表2各組大鼠蔗糖水攝取率與強迫游泳中靜止時間比較（略）23各組大

17、鼠強迫游泳中靜止時間的變化表2結果顯示，模型組大鼠強迫游泳中靜止時間延長,與正常對照組比較差異有顯著性意義（P001）；四逆散組大鼠靜止時間減少，與模型組比較差異有顯著性意義(P001)，與正常對照組比較差異無顯著性意義（P005）；歸脾湯組、溫膽湯組靜止時間與模型組比較差異無顯著性意義（P005）。3討論情志異常是肝郁證的主要病因,中醫(yī)七情學說與應激理論類似,情志病因的實質是不良生活事件所形成的心理應激；同時中醫(yī)認為情志與肝的關系最為密切,在對心理應激的調節(jié)過程中肝起著決定性的作用。臨床上與慢性心理應激相關的病證如抑郁癥,在診斷系統(tǒng)中的核心癥狀表現(xiàn)為興趣或愉快的減少和抑郁情緒,辨證多屬于中醫(yī)

18、“郁證”范疇,疏肝理氣解郁是最基本最重要的治則。前期研究建立了肝郁證動物模型的標準3，并使用多種不同應激條件隨機組合起來的慢性應激程序，模擬臨床上情志異常引發(fā)肝郁證的過程，并將10g/L蔗糖水攝取率與強迫游泳中靜止時間兩種行為學指標相結合，模擬人類肝郁證常見的抑郁、沉默寡言、默默不欲飲食以及喜嘆息等癥狀所反映的興趣缺乏和“無助感”的心理狀態(tài)，結合逍遙散、四逆散和四君子湯的效應，建立并初步驗證了慢性應激肝郁證大鼠模型2，4。本研究中的模型組大鼠10g/L蔗糖水攝取率減少、強迫游泳中靜止時間增加，疏肝方劑四逆散可有效對抗的結果與前述的研究相同，證明這一模型具有良好的再現(xiàn)性。研究表明，慢性應激狀態(tài)時

19、下丘腦垂體腎上腺軸(HPA)功能亢進，腎上腺皮質激素分泌增加是其主要表現(xiàn)之一8，常作為反映應激狀態(tài)的重要指標之一，皮質酮則是大鼠腎上腺皮質激素的主要形式。在本研究中，模型組大鼠血清皮質酮濃度顯著高于正常組，說明本研究的應激方案可明顯升高HPA軸活性，有明確的應激效應，也與我們以往的研究結果相同2，4。同時，具有疏肝作用的四逆散可以顯著抑制慢性應激引發(fā)的血清皮質酮濃度升高，而健脾養(yǎng)心方劑歸脾湯和理氣化痰方劑溫膽湯則均無此效應，提示了慢性應激引起的血清皮質酮濃度升高與肝郁病機、疏肝治法之間的密切關系。臨床上，對證候判斷的正確與否，最終要通過方劑的療效來驗證，因此以方測證是驗證動物模型中醫(yī)證候性質的

20、重要方法之一。應用以方測證方法進行研究，必須設立其他方劑對照，并應選擇功效相對明確、爭議較少、認識相對一致的方劑進行干預實驗，以增強測證的說服力9。前期研究4對比了經典的疏肝方劑四逆散、疏肝健脾方劑逍遙散和健脾方劑四君子湯對該模型行為學變化的效應，發(fā)現(xiàn)具有疏肝作用的四逆散和逍遙散均可明顯改善慢性應激引起的大鼠血清皮質酮含量升高，并使10g/L蔗糖水攝取率和強迫游泳中靜止時間恢復至正常水平，僅有健脾而無疏肝作用的四君子湯則無此效應，說明該模型屬于肝郁證的可能性較大，而與脾虛證無關。本研究從臨床應激相關疾病抑郁癥較常使用的方劑中選擇了歸脾湯和溫膽湯，與四逆散進行效應對比。結果顯示，四逆散可明顯改善

21、慢性應激引起的大鼠血清皮質酮含量升高、蔗糖水攝取率減少和強迫游泳中靜止時間延長，而歸脾湯和溫膽湯均無此效應，基本上排除了該模型與心脾兩虛或痰熱證相關的可能性，從另一側面支持該模型屬于肝郁的推論。在本研究中，各組大鼠體質量增加量未見顯著性差異，說明本研究中慢性應激刺激未能影響大鼠體質量，與我們以往的研究結果相同4。在一些中，慢性應激刺激對動物體質量影響的結果不一致10-11，提示體質量變化不能確定是由慢性應激引起。在肝郁證的多個診斷標準中，也沒有體質量減少，提示體質量變化對于本模型意義不大?！疚墨I】  1任路,李浩.關于肝郁證動物模型研究現(xiàn)狀及存在問題的思考J.中醫(yī)藥學報，2006，34（4）:44.2金光亮,南睿,郭霞珍.慢性應激肝郁證大鼠模型的建立J.北京中醫(yī)藥大學學報，2003，26（2）:18.3金光亮,王勝蘭.關于建立肝郁證動物模型的思考J.山東中醫(yī)藥大學學報,2004，28（6）:408.4于琦，金光亮.四逆散、逍遙散與四君子湯對慢性應激肝郁模型大鼠行為學影響的研究J.天津中醫(yī)藥,2007,6:509.5段富津.方劑學M.上海：上海技術出版社,1995：58，126，265.6Stathis Bekris，Katerina Antoniou，Spyros Daskas，et al.Behavioural