禽流感滅活抗原與佐劑配合飲水免疫對(duì)鴨消化道抗體分泌細(xì)胞的影響.docx

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2012,35(1):92-96JournalofNanjingAgriculturalUniversity王紅麗，康海泓，楊倩.禽流感滅活抗原與佐劑配合飲水免疫對(duì)鴨消化道抗體分泌細(xì)胞的影響J.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(1):92-96禽流感滅活抗原與佐劑配合飲水免疫對(duì)鴨消化道抗體分泌細(xì)胞的影響王紅麗，康海泓,楊倩.(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095)摘要:為探討鴨源禽流感滅活抗原與佐劑配合飲水免疫雛鴨的效果，應(yīng)用鴨源禽流感滅活抗原與復(fù)合黏膜免疫佐劑(CpG和/或葡萄糖)飲水免疫推鴨，檢測(cè)消化道(主要是咽和小腸)抗體分泌細(xì)胞的變化。首先分別從鴨的膽汁和血清中

2、粗提免疫球蛋白A(IgA)和IgG,經(jīng)純化后制備了兔抗鴨IgA和IgG,然后應(yīng)用免疫組化技術(shù)顯示鴨消化道IgA和gG分泌細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果表明:用禽流感滅活抗原配合Cp。和/或前萄糖飲水免疫后3、5和7周.消化道黏膜局部IgA分泌細(xì)胞面積均顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01),IgG分泌細(xì)胞(除首免后第3和7周小腸外)極顯著升高(P<0.01)。而單獨(dú)用禽流感滅活抗原和用葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫對(duì)消化道局部免疫水平影響不大。結(jié)論:鴨源禽流感滅活抗原配合免疫佐劑飲水免疫能夠提高雛鴨消化道局部免疫水平。關(guān)鍵詞：禽流感滅活抗原;飲水免疫;鴨;消化道;IgA分泌細(xì)胞;I

3、gG分泌細(xì)胞中圖分類號(hào):S858.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào)：1000-2030(2012)01-0092-05EffectoforalimmunizationwithinactivatedavianinfluenzavirusandadjuvantontheantibodysecretingcellsinduckdigestivetractWANGHong-li,KANGHai-hong,YANGQian*(CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity.Nanjing210095,China)Abstract:Inorde

4、rtoevaluatetheeflectsoforalimmunizationwiththeinactivatedavianinfluenzavirus(iAIV)vaccinewithadjuvantonducklings.TheareaofIgAandIgGsecretingcellsinthedigestivetract(mainlypharynxandsmallintestine)weredetectedafteroralimmunizationwithiAIVandadjuvantCpGwithorwithoutglucose.First,immunoglobulinA(IgA)an

5、dIgGwasisolatedfromduckbileandserumrespectively,andrabbitantiserumwasisolatedfrominoculatedrabbitsbypurifiedIgAandIgG.TheantibodysecretingcellswereshowedbySPA-HRPimmunohistochemicaltechnique.TheresultsshowedthattheareaofIgAandIgGsecretingcells(exceptforthe3rdand7thweekinsmallintestine)increasedsigni

6、licafitly(P<0.05orP<0.01)attheweeks3rd,5thand7thafteroralimmunizationwithiAIVandadjuvantCpGwith/withoutglucose.NosignificantchangeswerefoundintheducksimmunizedwithiAIVonlyoriAIVandglucose.Conclusion:theoralimmunizationwithiAIVtogetherwithadjuvantscoulddietlocalimmuneresponseinthedigestivetract

7、.Therefore,wespeculateditappearstobeefficaciousinsuppressingvirusreplicationandshedding.Keywords：inactivatedavianinfluenzavirus;oralimmunization;duck;digestivetract；IgAsecretingcells;IgGsecretingcells禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一種禽類傳染性疾病。AIV的宿主范圍廣泛，能感染所有已知的畬類。以前一直認(rèn)為鴨是AIV的貯存宿主。近幾年鴨感染AIV發(fā)病和死亡的報(bào)道也越來(lái)越多。鴨感染禽流感后不僅發(fā)

8、病死亡，而且病毒可通過(guò)糞便污染環(huán)境，繼而感染其他禽類和哺乳動(dòng)物，因此控制水禽禽流感的發(fā)生具有重要的意義。A1V主要通過(guò)消化道和呼吸道感染鴨，而后在腸道黏膜復(fù)制。如果增強(qiáng)咽和小腸黏膜免疫力，阻止病毒經(jīng)消化道和呼吸道途徑進(jìn)入體內(nèi)，控制病毒在腸道定殖復(fù)制將會(huì)直接切斷病毒的傳播。目前控制和預(yù)防禽流感主要依靠注射禽流感全病毒滅活疫苗(油乳劑滅活苗)，但肌肉注射滅活疫苗不能對(duì)黏膜局部產(chǎn)生有效刺激，也就不能誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答。研究表明黏膜免疫能夠引起有效的黏膜免疫應(yīng)答，口服弱毒疫苗可引起小腸黏膜中產(chǎn)生大量的IgA分泌細(xì)胞?？诜缁羁乖欠窨梢鹦∧c黏膜中抗體分泌細(xì)胞數(shù)量增加目前還未見(jiàn)有報(bào)道。滅活A(yù)1V配合適當(dāng)

9、的佐劑通過(guò)鼻腔免疫后局部呼吸道黏膜中產(chǎn)生較多的IgA分泌細(xì)胞*,由此，我們推測(cè)用佐劑配合滅活A(yù)IV飲水免疫會(huì)導(dǎo)致小腸收稿日期：2011-04-01基金項(xiàng)目：江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)0CBE2OO83O155)；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200803020)作者簡(jiǎn)介:王紅麗，碩士研究生。.通訊作者:楊倩，教授，主要從事黏膜免疫研究，E-mail：zxbyq。黏膜中產(chǎn)生大量的抗體分泌細(xì)胞。家禽的消化道中分布有大量的淋巴細(xì)胞，其中IgA分泌細(xì)胞對(duì)防止病原微生物的入侵發(fā)揮重要的作用。分泌型IgA(secretorylgA,sIgA)是黏膜免疫應(yīng)答過(guò)程中的主要效應(yīng)因子,具有防止細(xì)菌、病毒與黏膜結(jié)合，中

10、和病原體等多種功能：4_51oslgA的合成過(guò)程如下：IgA分泌細(xì)胞先合成IgA，在通過(guò)黏膜上皮的過(guò)程中再與上皮細(xì)胞的分泌片(secretorycomponent,SC)結(jié)合形成slgA'6，在黏膜表面(口腔、消化道、呼吸道及泌尿生殖道黏膜)形成一層保護(hù)膜，構(gòu)成防御病原微生物入侵機(jī)體的第一道屏障。因此，本試驗(yàn)選用鴨源禽流感H9N2滅活抗原與CpG配合，通過(guò)飲水方法來(lái)免疫雛鴨，檢測(cè)消化道IgA和IgG分泌細(xì)胞數(shù)量的變化，以探討滅活抗原飲水免疫對(duì)消化道局部黏膜免疫水平的影響，為飲水免疫法預(yù)防鴨感染禽流感提供理論基礎(chǔ)。1材料與方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物及處理7日齡雛鴨100只隨機(jī)分成5組，每組20只

11、。第1組用生理鹽水(每只0.30mL)飲水免疫;第2組用鴨源禽流感滅活抗原(每只0.30mL)飲水免疫;第3組用鴨源禽流感滅活抗原配合葡萄糖(每只0.30mL)飲水免疫;第4組用鴨源禽流感滅活抗原配合CPG(每只0.30mL)飲水免疫;第5組用鴨源禽流感滅活抗原配合CpG和菊萄糖(每只0.30mL)飲水免疫。試驗(yàn)鴨由江南家禽育種有限公司提供，血清中均無(wú)禽流感和新城疫特異性抗體。鴨源禽流感滅活抗原由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，病毒毒株為H9N2亞型，抗原效價(jià)為1：1024,雞胚半數(shù)致死量(ELDJlOmL-'o10日齡首次免疫，用注射器從口腔滴注；14日齡二次免疫,方法劑量與首次免疫相同。各組

12、分別于首次免疫后第3、5、7周宰殺取樣,每次每組6只，均取咽部、小腸,Bouins液固定，常規(guī)石蠟切片,切片厚8皿。1.2鴨IgA和IgG的提取及兔抗鴨IgA和IgG血清的制備12.1鴨IgA的提取從剛宰殺的鴨膽囊中收集膽汁120mL,4T、10000g離心30min,取上清液加入等體積的50%飽和硫酸鉉溶液，攪拌后于4幻過(guò)夜;次日4rJOOOOg離心30min,取上清液加人等體積的100%飽和硫酸鉉溶液，攪拌后于4T過(guò)夜;次日4無(wú)、15000g離心10min,取沉淀以PBS(0.01molL,pH7.4)溶解,4無(wú)透析48h得到粗提的IgAo將上述粗提的IgA經(jīng)SephadexG200凝膠層

13、析過(guò)濾，再過(guò)DEAE-SephadexA-52纖維素柱，得到純化的IgA。平衡液為0.015molLTris-HCl(NaCl0.06mol-L_,pH7.4)；洗脫液為0.015mol-L-1Tris-HCl(NaCl0.3mobf1,pH7.4)O純化的IgA通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行驗(yàn)證。1.2.2鴨IgG的提取采用辛酸-硫酸鉉法從鴨血清中提取IgG：新鮮鴨全血經(jīng)2500r-min-1離心取血清,用醋酸緩沖液稀釋后加入適量辛酸，離心去沉淀，上清液用硫酸鉉沉淀并懸于PBS中，透析除鹽，然后純化的IgG經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn)行驗(yàn)證。1.2.3兔抗鴨IgA和IgG血清的制備按常規(guī)方法，用純

14、化的IgAJgG分別經(jīng)背部皮下接種體質(zhì)量為23kg的成年健康雄性新西蘭兔。免疫后每周用瓊擴(kuò)試驗(yàn)測(cè)定血清中IgA和IgG抗體效價(jià)，待效價(jià)達(dá)到132以上時(shí)心臟采血，分離血清，即為兔抗鴨IgA和兔抗鴨IgG高免血清，凍干,-20幻保存。1.3SPA-HRP間接染色法檢測(cè)IgA和IgG分泌細(xì)胞石蠟切片脫蠟后放入0.8%H2O2處理30min,用含0.4%Triton-100的PBS(PH7.6)洗滌3次，每次5min；滴加5%正常山羊血清封閉30min；棄羊血清后分別滴加適當(dāng)稀釋比例的兔抗鴨IgA或兔抗鴨IgG高免血清,4T過(guò)夜;用含0.4%Triton-100的PBS(pH7.6)洗滌3次，每次5m

15、in；滴加適當(dāng)稀釋的SPA-HRP(Sigma公司)，37幻作用60min；Tris-HCl緩沖液(0.05molL,pH7.6)洗滌15min；DAB顯色，晾干，中性樹(shù)膠封片。對(duì)照組用PBS分別替代兔抗鴨IgA和兔抗鴨IgG。1.4組織學(xué)觀察與統(tǒng)計(jì)用OlympusBH-2顯微鏡觀察并拍照。利用圖像分析系統(tǒng)測(cè)雖咽、小腸的IgA和IgG分泌細(xì)胞面積。每組選切片10張，每張切片選10個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。15數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)采用Excel2003軟件初步處理后再用SPSS17.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1鴨IgA和IgG結(jié)構(gòu)蛋白的驗(yàn)證電泳凝膠染色掃描結(jié)果顯示出2條清晰的條帶(圖1),其中一條

16、相對(duì)分子質(zhì)量為70X10,72X1O3，是鴨IgA的重鏈；另一條相對(duì)分子質(zhì)量約為26x103,是鴨IgA的輕鏈。重鏈和輕鏈的分子質(zhì)量與楊曉燕報(bào)道的相同，但本試驗(yàn)的SDS-PAGE電泳結(jié)果沒(méi)有第3條帶(J鏈)，可能是由于鴨slgA在凝膠層析的過(guò)程中J鏈被降解。提純的IgG經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示有2條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為67x10,和26x103,分別為IgG的重鏈和輕鏈(圖1)。1234MM./X105 94.4 66.245.0圖1提純的鴨IgA和IgG的SDS-PAGE電泳圖Fig.1SDS-APGEeiectrophoersisofduckIgAandIgGlane1,2.IgA

17、；3,4.IgG(10|iX,5gX)；M.Marker 33.8 27.02.2鴨源禽流感滅活抗原飲水免疫對(duì)IgA分泌細(xì)胞的影響2.2.1IgA分泌細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)IgA分泌細(xì)胞在雛鴨咽、小腸中均有分布(圖2)。IgA分泌細(xì)胞為圓形或橢圓形，胞質(zhì)深染成棕褐色。咽的IgA分泌細(xì)胞主要分布于黏膜固有層，并緊貼復(fù)層扁平上皮基底膜內(nèi)側(cè)，疏松結(jié)締組織中IgA分泌細(xì)胞分布較少,腺體周圍也有IgA分泌細(xì)胞分布；另外發(fā)現(xiàn)在咽的扁平上皮外染色呈強(qiáng)陽(yáng)性。小腸的IgA分泌細(xì)胞主要分布在腸絨毛黏膜固有層和黏膜固有層及腸腺周圍，其中腸絨毛基部數(shù)量較多。小腸的IgA分泌細(xì)胞數(shù)量要多于咽部。圖2咽(a)和小腸(b)IgA分

18、泌細(xì)胞(f示分泌細(xì)胞；a.xl00,b.x200)Fig.2IgAsecretingcellsinthelaminapropriaofphnryx(a)andsmallintestine(b)(xindicatingIgAsecretingcells)2.2.2咽IgA分泌細(xì)胞面積的變化如圖3-A所示，首免后第3、5和7周，用CpG或用CpG和葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫錐鴨后，咽中IgA分泌細(xì)胞面積比單獨(dú)用禽流感滅活抗原免疫顯著或極顯著增加(P<0.05,P<0.01)。在整個(gè)免疫期，單獨(dú)用滅活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫后,IgA分泌細(xì)胞面積與口腔滴注生理

19、鹽水相比均無(wú)明顯變化(P>0.05)o2.2.3小腸IgA分泌細(xì)胞面積的變化如圖3-B所示，首免后第3、5和7周，用CpG或用CpG和葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫雛鴨后,小腸中IgA分泌細(xì)胞面積比單獨(dú)用禽流感滅活抗原免疫顯著或極首免后時(shí)間/周Timeafterthefirstimmunization生理鹽水Nonnalsodium;E3抗原Antigen;0葡萄糖+抗原Glucose+antigen;CpG+抗原CpG+antigen；CpG+葡萄糖+抗原CpG+glucose+antigen圖3免疫后咽(A)和小腸(B)組織單位視野中IgA分泌細(xì)胞面積的變化Fig.3Changeo

20、ftheareaofIgAsecretingcellsinphnryx(A)andsmallintestineB)ofunitfieldafterimmunization顯著增加(P<0.05,P<0.01)o在整個(gè)免疫期，單獨(dú)用禽流感滅活抗原或用葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫后，小腸IgA分泌細(xì)胞面積與口腔滴注生理鹽水相比差異不顯著(P>0.05)。2.3鴨源禽流感滅活抗原飲水免疫對(duì)IgG分泌細(xì)胞的影響2.3.1IgA分泌細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量IgG分泌細(xì)胞的位置及細(xì)胞形態(tài)與IgA分泌細(xì)胞大致相同(圖4)。與IgA分泌細(xì)胞數(shù)扯相比，咽和小腸中IgG分泌細(xì)胞的數(shù)量較少。圖4咽(a

21、)和小腸(b)的IgG分泌細(xì)胞(t示分泌細(xì)胞；a.xlOO,b.x200)Fig.4IgGsecretingcellsinthelaminapropriaofphnryx(a)andsmallintestine(b)(findicatingIgGsecretingcells)2.3.2咽中IgG分泌細(xì)胞面積的變化如圖5-A所示，首免后第3、5、7周，用CpG或用CpG和葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫錐鴨后，咽中IgG分泌細(xì)胞面積均比單獨(dú)用禽流感滅活抗原極顯著增加(P<0.01)。在整個(gè)免疫期，單獨(dú)用滅活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫后,IgG分泌細(xì)胞面積與口腔滴注生理鹽

22、水相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)o2.3.3小腸中IgG分泌細(xì)胞面積的變化如圖5-B所示，首免后第3周，用CpG和菊萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫雛鴨后,小腸中IgG分泌細(xì)胞面積比單獨(dú)用禽流感滅活抗原免疫極顯著增加(P<0.01)°首免后第5周，用CpG或用CpG和葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫錐鴨后,小腸中IgG分泌細(xì)胞面積均比單獨(dú)用禽流感滅活抗原免疫極顯著增加(P<0.01)。首免后第7周，各組小腸中IgG分泌細(xì)胞面積相似，均無(wú)顯著差異。在整個(gè)免疫期，單獨(dú)用滅活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫后，小腸IgG分泌細(xì)胞面積與口腔滴注生理鹽水相比均無(wú)

23、顯著差異(P>0.05)o15O12O9O6O3OHs=8Majors蚤jo誨,是集澆去V8-15O12O9O6O3OHs=8Majors蚤jo誨,是集澆去V8-首免后時(shí)間/周Timeafterthefirstimmunization生理鹽水Normalsodium；抗原Antigen；0的萄糖+抗原Glucose+antigen；CpG+$t原CpG+antigen；0CpG+葡萄糖原CpG+glucose+antigen圖5免疫后咽(A)和小腸(B)組織單位視野中IgG分泌細(xì)胞面積的變化Fig.5ChangeoftheareaofIgGsecretingcellsinphnryx(A

24、)andsmallintestine(B)ofunitfieldafterimmunization3討論.禽流感病毒主要在鴨的腸道復(fù)制然后以較高的滴度從糞便中排出，因此增強(qiáng)腸道免疫力能夠有效阻止病毒在腸道復(fù)制，減少排毒。而且，禽流感病毒主要通過(guò)消化道和呼吸道，尤其是消化道進(jìn)入鴨體內(nèi)，通過(guò)消化道免疫可直接刺激咽產(chǎn)生局部抗體，以阻止禽流感病毒入侵，又可增強(qiáng)腸道黏膜免疫力，限制病毒在腸道復(fù)制。IgA分泌細(xì)胞是局部黏膜主要的免疫活性細(xì)胞，在阻止腸道病毒粘附和入侵中起關(guān)鍵作用-，分泌細(xì)胞數(shù)量的變化已成為評(píng)價(jià)小腸黏膜免疫力的指標(biāo)之一消化道免疫活性細(xì)胞數(shù)量的增加能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的抵抗力和切斷病毒的侵襲途徑。

25、本試驗(yàn)結(jié)果表明，鴨源禽流感滅活抗原配合CpG飲水免疫后咽和小腸局部IgA和IgG分泌細(xì)胞數(shù)量均顯著增加,表明免疫后消化道黏膜局部免疫力增強(qiáng)，這對(duì)防止禽流感病毒從咽入侵和在腸黏膜復(fù)制，減少或阻斷禽流感病毒從糞便中散播將發(fā)揮有效作用。本研究還發(fā)現(xiàn),IgA在咽的扁平上皮外也呈抗體陽(yáng)性反應(yīng),這可能是由于IgA與黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的分泌片(SC)結(jié)合,通過(guò)上皮細(xì)胞的吞飲作用進(jìn)入胞漿，然后釋放在上皮細(xì)胞游離面或腺腔中，使黏膜表面呈陽(yáng)性反應(yīng)。slgA在黏膜表面形成保護(hù)層，能防御病原微生物從黏膜表面侵入。CpG是一種有效的黏膜免疫增強(qiáng)劑，能通過(guò)與樹(shù)突狀細(xì)胞相互作用,促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，能夠有效誘導(dǎo)黏膜局部和全身

26、性免疫反應(yīng)i，4-,6JoCpG與抗原聯(lián)合使用能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。CpG不被消化酶降解，能夠用于口服免疫(，J6-，71o本試驗(yàn)結(jié)果表明，用CpC與禽流感H9N2滅活抗原配合口服免疫引起消化道局部黏膜免疫活性細(xì)胞數(shù)量增加，消化道局部黏膜免疫力增強(qiáng)。高濃度葡萄糖可使緊密連接相關(guān)蛋白Zo-1表達(dá)減少，細(xì)胞間連接松懈，增加黏膜上皮細(xì)胞的通透性。本試驗(yàn)中添加高濃度葡萄糖意在促進(jìn)禽流感滅活抗原透過(guò)上皮進(jìn)入上皮下組織，從而直接剌激組織中的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，單獨(dú)用葡萄糖配合禽流感滅活抗原飲水免疫鴨后，消化道黏膜局部IgA和IgG分泌細(xì)胞面積變化不大，應(yīng)用CpG和葡萄糖配合禽流感滅活抗原

27、與只用CpG配合禽流感滅活抗原飲水免疫鴨效果接近，表明菊萄糖起的作用并不大,CpG有可能經(jīng)過(guò)小腸上皮吸收，刺激固有層中淋巴細(xì)胞的分化和增殖。綜上所述,禽流感滅活抗原與黏膜免疫增強(qiáng)劑CpG配合飲水免疫能有效提高鴨消化道黏膜局部的免疫應(yīng)答，但能否直接切斷病毒侵入機(jī)體的途徑和阻止病毒在腸道粘附復(fù)制和病毒排出還需進(jìn)一步驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)：IZhangX,ZhangX,YangQ.EffectofcompoundmucosalimmuneadjuvantonmucosalandsystemicimmuneresponsesinchickenorallyvaccinatedwithattenuatedNewc

28、astle-discaftevaccineJ.Vaccine,2007,25(17)；3254-326221張曉文，楊倩.禽流感火活抗原與佐劑配合鼻腔免疫對(duì)鳴呼吸道抗體分泌細(xì)胞的影響J.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(1):94-983楊倩，練高建,黃國(guó)慶，等.半胱胺對(duì)房小腸黏膜中分泌型IgA細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的影響J.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25(2)：89924HaydayA.VineyJL.Thein»andoutsofbodysurfaceimmunologyJ.Science,2000,290(5489)；97-IOO5PetersonDA,McNultyNP.Gu

29、nigeJL,etal.IgAresponsetosymbioticbacteriamamediatorofguthomeostasisJ).CellHo»t&Microbe,2007,2(5):328-339MesteckyJ,McGheeJR.ImmunoglobinA(IrA):molecularandcellularinteractionsinvolvedinIgAbiosynthesisandresponseJJ.AdvancesImmunology,1987,40:153-2456 楊宗照，華榮虹，張書(shū)等.鴨IgC提取方法的比較試就JL中國(guó)獸醫(yī)科技,2001.31

30、(4):26-27楊曉燕.家鴨人工感染費(fèi)瘟強(qiáng)毒株的動(dòng)態(tài)分布、黏膜免疫及對(duì)腸道菌群的影響們.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),20067 PerdueML,SuarezDL.StructuralfeaturesoftheavianinfluenzavimshemagglutininthatinfluenceviralcncefJ.VeterinaryMicrobiology,2000,74(1/2):77-86JOKidaH.YanagawaR,MabmukaY.DuckinfluenzalackingevidenceofdiseasesignsandimmuneresponseJ.InfeclionImmunity,198(),30(2):547-55311AgnelloD,HervGCA,LavauxA,etal.Intrarectalimmunizationwithrotavirus2/6vinw-likeparticlesinducesanantirotavirusimmuneresponselocalizedintheintestinalmucosaandprotectsagainstrotavirusinfectioninmiceJ.JournalofVirology,2006,80(8)；3823-383212YangX,QiX,ChengA,e