泰國(guó)輸華斑節(jié)對(duì)蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測(cè)與分析.docx

1、泰國(guó)輸華斑節(jié)對(duì)蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒的檢測(cè)與分析hi于力，劉瑩，鄭曉聰，王津津.賈鵬，何俊強(qiáng)，劉黃(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045)摘要：為研究進(jìn)口斑節(jié)對(duì)蝦傳染性皮下和造血器官壞死病毒(InfectiousHypodermalandHematopoieticNecrosisVirus,IHHNV)的風(fēng)險(xiǎn)，本文采用了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)2015版手冊(cè)中推薦的PCR方法，對(duì)2015年從泰國(guó)輸華的329批次斑節(jié)對(duì)蝦進(jìn)行了IHHNV檢測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其陽(yáng)柱率高達(dá)36.8%,且主要是感染1型和2型，以及風(fēng)險(xiǎn)不明的未知型.因此.來(lái)自秦國(guó)的斑節(jié)對(duì)蝦具有較高的

2、IHHNV傳入風(fēng)險(xiǎn).應(yīng)加強(qiáng)針對(duì)1HHNV的進(jìn)口監(jiān)測(cè)，戒少其對(duì)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖的影響。關(guān)鍵詞：傳染牲皮下和造血器官壞死病毒：斑節(jié)時(shí)蝦：未如&因型：風(fēng)險(xiǎn)中圖分類號(hào)：S851.34文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1005-944X(2016)06-0083-04DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.024TestandAnalysisofinfectiousHypodermalandHematopoieticNecrosisVirusonPenaeusmonodonImportedfromThailandYuLi.LiuYing.ZhengXiaocong.WangJ

3、injin.JiaPeng.HeJunqiang.LiuHong(AnimalandPlantInspectionandQuarantineTechnologyCenterofShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau.Shenzhen.Guangdong518045)Abstract:InordertostudytherisksofInfectiousHypodermalandHematopoieticNecrosisVirus(IHHNV)ofimportedPenaeusmonodon.PCRmethodsrecommendedbyOI

4、Emanual(2015)wereusedtotestIHHNVon329batchesofPenaeusmonodonimportedfromThailand.Theresultsshowedthatpositiveratewas36.8%,andmajorgenotypesweregenotype1.2andunknowntypewithunclearrisk.Therefore,theIHHNVriskofP.monodonimportedfromThailandishigh.SuggestionsofreinforcingthesurveillanceofIHHNVtocontrolt

5、hisdiseaseandlimitthenegativeefleetonshrimpaquacultureofChinawereputforward.Keywords:IHHNV:Penaeusmonodon:unknowngenotype:risks對(duì)蝦傳染性皮下和造血器官病是養(yǎng)殖對(duì)蝦的更要疫病，口J引起極高的死亡率(>90%)或生&發(fā)育畸形對(duì)世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)具有嚴(yán)取影響。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列入須通報(bào)疫病。其病原是傳染性皮卜和造血器官病毒(IHHNV),其宿'上為斑p'對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、南美白對(duì)蝦(P.vannamei)和南美藍(lán)對(duì)

6、蝦(P.stylirostris)等。IHHNV屬于細(xì)小病旋科，是己知最小的對(duì)基金項(xiàng)目：國(guó)家魘檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(20101K007)通訊作者：劉拉蝦病毒。病毒粒子大小為20-22nm,基因組為單鏈DNA,長(zhǎng)約3.9kb"該病誰(shuí)至少有3個(gè)基因型，其中1型主要分布在美洲和東亞，2型主要分布在東南亞，這兩種基因型均為感染型(5。3型又分為3A型和3B型，其中3A型主要分布在東非、印度和澳大利亞等地區(qū)，而3B型則主要分布在印度太*洋地區(qū)。3A型和3B取將部分基因樣列倏入宿主對(duì)蝦的基因組，但不具備感染性氣本研究采用了2015版OIE手冊(cè)推薦的PCR方法，對(duì)2015年從泰國(guó)輸華的斑節(jié)對(duì)蝦進(jìn)行了

7、檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查與風(fēng)險(xiǎn)分析。1材料與方法1.1樣品與對(duì)照樣品為2015年從泰國(guó)進(jìn)口到中國(guó)的活斑肖對(duì)蝦,共329批次，均無(wú)發(fā)育畸形等典型臨床癥狀。取樣部位為便和皮卜如織。陽(yáng)性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室保“的IHHNVRI性組織，陰性對(duì)照為健康的斑日對(duì)蝦組織。1.2引物合成引物采用2015版OIE手冊(cè)推薦的PCR引物,洋見(jiàn)&1，由生工生物匚程(上海)有限公訕合成。表1IHHNV檢測(cè)引物引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小序列(5-3，)392F392R392bpGGG-CGA-ACC-AGA-ATC-ACT-17AT('-CGG-AGG-AAT-CTG-ATG-TG3O9F3()9hpTCC-AAC-

8、ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-AHRT(iT-CTG-CTA-CGA-TCiA-TTA-TCC-AMG831Fl(iX3IR831bpTT(i-(i(i(i-AT(i-CAG-('AA-TAT<TAT-CC'A-CT(；-ATC-G(iA-CTDNA提取將采集的集組織勻漿后提取DNAo本實(shí)驗(yàn)用到的組織均使用QIAampDNAMiniQIAcubeKit(QIAGEN)進(jìn)行DNA提取。1.3 PCR檢測(cè)使用ExTaq(TAKARA)進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物終濃度為400nM根據(jù)O1E乒冊(cè)(2015版),先使用392F/R引物對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)。若有陽(yáng)性，則使用309F

9、/R與MG831F/R引物進(jìn)行分型。以上3對(duì)引物的PCR反應(yīng)程序均為95C5min,35個(gè)循環(huán)(95C30s.55,C30s,72°CImin),72,C7min1.5電泳與測(cè)序PCR產(chǎn)物使用毛細(xì)管電泳儀QIAxccI(QIAGEN)來(lái)分析，陽(yáng)性樣品送華大基因進(jìn)行測(cè)序,與NCBIBLAST后，相似度95%以上確定為陽(yáng)性。2結(jié)果2015年從329批斑節(jié)對(duì)蝦中,共檢出IHHNV陽(yáng)性121批，陽(yáng)性率為36.8%。按照OIE手冊(cè)(2015版).引物392F/R能檢出IHHNV的所有堆因型，而引物309F/R能檢出I型和2型，MG831F/R能檢出3A和3B型。若392F/R引物陽(yáng)性，而309

10、F/R和MG831F/R均為陰性,則無(wú)法判斷其基因型,本文暫稱為未知型(圖I)。檢測(cè)結(jié)果匯總?cè)缬?與圖2所示.使用卡方檢驗(yàn),季度之間陽(yáng)性率無(wú)顯著差異(P>0.05)。IHHNV各基因型所占的百分比例如圖3所示。圖IIHHNV未知型電泳注:1-2.引的392F/R論洲撻果，可£392bp大小條帶：3.引物392FR陰杜時(shí).峨：4.引物392FR陽(yáng)姓時(shí)恐tSW.引物3(州R檢洲站黑.未見(jiàn)條帝：7.引物309F/R陰柱時(shí)熙；8.引物3()91R陽(yáng)性對(duì)熙：9-10.引物MG831F/R檢測(cè)拈果，表見(jiàn)務(wù)帝：II.引物MG831F/RH時(shí)熙:12.引物MG83IF/R陽(yáng)，性時(shí)熙<22

11、015年泰國(guó)輸華斑節(jié)對(duì)蝦IHHNV檢測(cè)結(jié)果季度第二度第三羊度了，叫r度樣品總數(shù)7292-63102陽(yáng)性總數(shù)26(36.1%)30(32.6%)24(38.1%)41<40.2%)I型/2型9(12.5%)II(12.0%)12(19.0%)25(24.5%)2015年第、二季度的IHHNVPII性率相對(duì)較低,第三、四季度相對(duì)較高。每個(gè)季度的基因型主要為未知型和1/2型，而3A/3B以及1/2和3A/3B型共存的所占比較很小。泰國(guó)2015年輸華斑節(jié)對(duì)蝦的IHHNV各基因型所占的百分比中，I型/2型所占比例最大,為47%:未知型占44%:3A/3B型占6%：1型/2型和3A/3B型占3%（圖

12、3）。3A/3B型1型/2型和圖3泰國(guó)輸華斑節(jié)對(duì)蝦HIHNV基因型分布3討論本研究采用了OIE手冊(cè)（2015版）推薦的PCR方法，對(duì)2015年從泰國(guó)輸華的斑打?qū)ξr進(jìn)行TIHHNV檢測(cè)分析。結(jié)果表明.總體陽(yáng)性率高達(dá)36.8%,說(shuō)明IHHNV感染的斑節(jié)對(duì)蝦未必會(huì)表現(xiàn)出臨床癥狀，這與OIE手冊(cè)所介紹的情況-致。陽(yáng)性樣品中也要是感染1型和2型，以及未知風(fēng)險(xiǎn)的未知型。仃研究發(fā)現(xiàn)，斑廿對(duì)蝦對(duì)IHHNV感染具有較高的耐受性叫，這也與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,說(shuō)明IHHNV對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦致死率低，使M成為攜帶與傳播IHHNV的風(fēng)險(xiǎn)俱從季節(jié)而言,第_、:季度的IHHNV陽(yáng)性率相對(duì)較低，而第1、四季度相對(duì)較高，但無(wú)顯著差異，可

13、能是由偶然因素或波動(dòng)所引起的。關(guān)于未知型，在OIE手冊(cè)中未見(jiàn)相關(guān)描述，相關(guān)文獻(xiàn)也未有提及。但有文獻(xiàn)指出IHHNV的基因變異率較高'5，IL現(xiàn)行方法無(wú)法區(qū)分出所有的基因型|Ml因此未知型可能是IHHNV的突變型，或者是由于現(xiàn)行方法的局限未能區(qū)分出的基因型,所以對(duì)其感染性以及風(fēng)險(xiǎn)未知。因此對(duì)于IHHNV未知型的樣品應(yīng)該謹(jǐn)慎處理，同時(shí)也應(yīng)對(duì)其進(jìn)行深入研究。本研究還觀察到4批1型/2型和3A/3B型共存的現(xiàn)象，這與Tang等3）觀察到的現(xiàn)象致，說(shuō)明即使確認(rèn)J'作感染型IHHNV,也不能排除其含有感染型的可能。所以在實(shí)際檢測(cè)工作中應(yīng)同時(shí)使用309F/R和MG831F/R引物進(jìn)行分型分析。

14、綜上所述,來(lái)自泰國(guó)的斑節(jié)對(duì)蝦具有較高的傳入IIIIINV風(fēng)險(xiǎn)，目.未知風(fēng)險(xiǎn)的未知基因用占仃近一半的比例。即使斑節(jié)對(duì)蝦本身對(duì)IHHNV耐受，但也可能將其傳播給其他易感對(duì)蝦，造成極高的死亡率。我國(guó)是對(duì)蝦養(yǎng)殖大國(guó).同時(shí)也從東南亞進(jìn)II大揪對(duì)蝦,因此應(yīng)加強(qiáng)IHHNV的進(jìn)口監(jiān)測(cè),以更好地防控該病，減少其對(duì)我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖的影響。參考文獻(xiàn)：(ILightnerDV.RedmanRM.BellTA.InfectioushypodermaIandhematopoieticnecrosis,anewlyrecognizedvirusdiseaseofpenaeidshrimpJ.JInvertebratePatho

15、l.1983.42(I)：62-70.2 Lightner【)V,RedmanRM.BellTA.etal.DetectionofIHIINvirusinPenaeusslylirostrisandP.vannameiimportedintoilawaiiJ.JWorldAquacultureSociety.1983.14(I/2/3/4)：212-225.3 ChayabunikulK.NashG.PratanpipatP.etal.Multiplepathogens(bundingrowth-retardedblacktigershrimpPenaeusmonodoncultivatedi

16、nThailandJ.DisAquat()rg.2004.60:89-96.4 BrayWA.LawrenceAL.Leung-irujilloJR.TheelTcclofsalinityongrowthandsurivalofPenaeusvannamei.withobservationsontheinteractionofIHHNvirusandsalinityJ.Aquaculture.1994.122:133-146.5 FauquetCM.MayoMA.ManiloffJ.etal.Virustaxonomy:classificationandnomenclatureofviruse

17、s,eighthreportoftheinternationalcommitteeontaxonomyofviruses(M).ElsevierAcademicPress.2005:1259.6 BonamiJR.TrumperB.MariJ.etal.PurificationandcharacterizationofIHHNvirusofpenacidshrimps|J.J(ienVirol,1990.71:2657-2664.7 NunanLM.PoulosBT.LightnerDV.Useofpolymerasechainreaction(PCR)forthedetectionofinf

18、ectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)inpenaeidshrimpfJ.MarBiotechnoL2000(2)：319-328.8 TangKFJ,LightnerDV.Lowsequencevariationamongisolatesofinfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)originatingfromHawaiiandtheAmericas(J).DisAquatOrg,2002,49:93-97.|9TangKEJ.PoulosBT,Wang

19、J.etal.Geographicvariationsamonginfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)isolatesandcharacteristicsoftheirinfection(J|.DisAquatOrg.2003.53:91-99.10 TangKFJ.LightnerDV.Infectioushypodermaland(下轉(zhuǎn)第89頁(yè))偵查總隊(duì)：你總隊(duì)關(guān)于對(duì)“速生雞”養(yǎng)殖過(guò)程中使用的違禁藥品如何定性的請(qǐng)示收悉，經(jīng)商最高人民檢察院、最高人民法院、農(nóng)業(yè)部，現(xiàn)就你總隊(duì)請(qǐng)示事項(xiàng)答復(fù)如下:金剛烷胺、利巴韋林是目前禁止

20、經(jīng)營(yíng)和使用的藥品，地塞米松為糖皮質(zhì)激素，屬激素類產(chǎn)品，臨床用于馬、牛、豬、羊等家畜和犬、貓等寵物的炎癥性、過(guò)敏性疾病，根據(jù)獸藥管理?xiàng)l例，禁止在飼料和動(dòng)物飲水中添加激素類藥品。如查實(shí)在生雞養(yǎng)殖過(guò)程中添加金剛烷胺、利巴韋林或地塞米松，構(gòu)成生產(chǎn)、銷售有毒有害食品罪和生產(chǎn)、銷售偽劣產(chǎn)品罪，請(qǐng)你總隊(duì)加大案件偵辦力度，盡快偵結(jié)此案，及時(shí)移送起訴，依法追究不法分子刑事責(zé)任?！?認(rèn)為屬于非禁用物質(zhì)的依據(jù)2.1農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告該公告廢止的獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)主要有5類，其中第二類是金剛烷胺類等，主要理由是因?yàn)槿擞每共《舅幰浦搏F用，缺乏科學(xué)規(guī)范、安全有效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用于動(dòng)物病毒性疫病不但給動(dòng)物疫病控制帶來(lái)不良后果，而且

21、影響國(guó)家動(dòng)物疫病防控政策的實(shí)施?？梢?jiàn)，金剛烷胺類等人用抗病毒藥只是因?yàn)榻o動(dòng)物疫病控制帶來(lái)不良后果而沒(méi)批準(zhǔn)為獸藥，而非因?yàn)橛绊憚?dòng)物性食品安全而禁止使用。而且關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知（農(nóng)醫(yī)發(fā)（2005）33號(hào)）第四條規(guī)定“列入農(nóng)業(yè)部公告第560號(hào)序號(hào)2的金剛烷胺、金剛乙胺、阿昔洛韋、嗎啪（雙）M（病毒靈）、利巴韋林等及其鹽、酯的單、復(fù)方制劑等獸藥，需通過(guò)獸藥注冊(cè)相關(guān)程序經(jīng)我部嚴(yán)格審查批準(zhǔn)后，方可使用于其他動(dòng)物病毒性疫病?！笨梢?jiàn)農(nóng)業(yè)部并未完全將其視為禁用物質(zhì)，尚存在著轉(zhuǎn)為獸藥使用的可能。2.2關(guān)于辦理危害食品安全刑事案件適用法律若干問(wèn)題的解釋（法釋（2013）12號(hào)）解釋第二十條規(guī)定：

22、“下列物質(zhì)應(yīng)當(dāng)認(rèn)定為有毒、有害的非食品原料：（一）法律、法規(guī)禁止在食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)活動(dòng)中添加、使用的物質(zhì)：（二）國(guó)務(wù)院有美部門(mén)公布的食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單上的物質(zhì)：（三）國(guó)務(wù)院有關(guān)部門(mén)公告禁止使用的農(nóng)藥、獸藥以及其他有毒、有害物質(zhì)：（四）其他危害人體健康的物質(zhì)?！卑凑沾藰?biāo)準(zhǔn)，金剛烷胺、金剛乙胺等，既不屬于法律法規(guī)禁止的，也不屬于食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單卜.的物質(zhì)，更不屬于公告禁止使用的獸藥及其他有毒、有害物質(zhì)，只屬于通知、批復(fù)認(rèn)定禁止使用的物質(zhì)。3討論綜上所述，金剛烷胺、金剛乙胺、阿昔洛韋、嗎啡（雙）M（病毒靈）、利巴韋林等，屬于禁用物質(zhì)的規(guī)定不明確、不嚴(yán)謹(jǐn)，為執(zhí)法工作帶來(lái)困難。為嚴(yán)厲打擊此類物質(zhì)的非法生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)、使用，確保動(dòng)物產(chǎn)品安全，建議農(nóng)業(yè)部要以公告等方式公開(kāi)明確。（責(zé)任編輯：白雅娟）(上接第85頁(yè))hematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)inthegenomeoftheblacktigerprawnPenaeusmonodonfromAfricaandAustraliafJ,VirusRes,2006,118:185-191.11 FlegelTW,NielsenL.ThamavitV,etal.Presenceofmultiplevirusesinnon