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1、一個(gè)AB型開米拉家系遺傳狀態(tài)的研究 08-03-04 15:26:00 編輯:studa20 作者:楊寶成 喻瓊 蘇宇清 周丹 金士正 李茜 梁延連 鄧志輝【摘要】 為了研究罕見開米拉血型家系的基因遺傳狀態(tài),對(duì)先證者家系部分樣本進(jìn)行ABO基因序列測(cè)定,用流式反向序列特異性寡核苷酸探針方法測(cè)定HLAA、B、DRB1基因位點(diǎn),用PCR序列特異性引物法測(cè)定HLAA、B、DRB1基因位點(diǎn),對(duì)16個(gè)短串聯(lián)重復(fù)片段位點(diǎn)進(jìn)行熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn): A3B3型家系的2個(gè)體中,ABO基因、HLAB、DRB1基因、多個(gè)STR位點(diǎn)出現(xiàn)了2個(gè)以上的等位基因。結(jié)論: 利用基因分型技術(shù)分析開米拉血型能清楚地提示此罕
2、見血型的遺傳狀態(tài),增進(jìn)了對(duì)此遺傳方式的認(rèn)識(shí)。 【關(guān)鍵詞】 開米拉血型,ABO, HLA, STR Abstract In order to study the genetic status of a rare chimeric family, some samples of A3B3 family were identified by sequencing of ABO gene; flowrSSO and PCRSSP were used to detect loci of HLAA,B,DRB1 genes, and multiplex amplifying with fluorescen
3、cedye were performed for 16 short tandem repeat (STR) loci. The results indicated that two individuals from A3B3 family contained more than two alleles at ABO gene, HLAB,DRB1 and some STR loci. In conclusion, analysis of chimeric blood group by using genotyping techniques clearly demonstrating genet
4、ic status of this rare chimeric blood group promotes further elucidation of the existing state of specific genetic status. Key words Chimeric blood group, ABO, HLA, STR 開米拉的定義是個(gè)體細(xì)胞來自兩個(gè)或多個(gè)不同的受精卵。人類血型開米拉可能是遺傳性的,也可能是在移植、輸血過程中通過輸注異源的造血細(xì)胞而獲得的。先天性開米拉發(fā)生在兩個(gè)受精卵或多個(gè)受精卵的胎兒發(fā)育中。人類開米拉血型是非常罕見的,常在ABO血型鑒定中存在著混合外觀的凝集而
5、引起注意1-3。我們實(shí)驗(yàn)室在1例ABO亞型的研究中發(fā)現(xiàn)其家系存在開米拉現(xiàn)象,現(xiàn)報(bào)道如下。 材料和方法 對(duì)象 先證者是1名23歲的男性無償捐血者,他的ABO血清學(xué)定為A3B3型,采集到先證者及其弟弟的血液不抗凝血樣5 ml。由于先證者父親去世,未采集到其血液標(biāo)本。對(duì)先證者母親、哥哥、嫂子及孩子共計(jì)4人所采集標(biāo)本由于條件所限,未能抗凝,只作了ABO血清學(xué)血型測(cè)定,而未能作進(jìn)一步分析。本家系個(gè)體均為無輸血史和移植史的健康個(gè)體。 血型血清學(xué)檢測(cè) 血型正反定型按中國輸血技術(shù)操作規(guī)程操作進(jìn)行。其中試劑單克隆抗A、抗B血清(BIOSCOT, Serological Ltd, UK),抗AB血清(Immuco
6、r Inc, Norcross, GA30071, USA),抗H植物凝集素(長(zhǎng)春博德公司產(chǎn)品),反定型紅細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自制。 基因組DNA提取 PUREGENE快速鹽析法抽提先證者與弟弟2個(gè)樣本的基因組DNA,DNA終濃度調(diào)節(jié)至100 ng/l,A260/A280在1.70。 ABO基因第6、第7外顯子直接序列檢測(cè) 參照Olsson設(shè)計(jì)的2對(duì)引物4,5CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC3, 5CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA3,用于擴(kuò)增ABO基因第6外顯子。5GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC3,5CGGGATCCCCGTCCGCCTG
7、CCTTGCAG3,用于擴(kuò)增ABO基因第7外顯子,中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 J Exp Hematol 2007; 15(2)一個(gè)AB型開米拉家系遺傳狀態(tài)的研究引物由上海生物工程所合成。PCR擴(kuò)增體系包括:每種dNTP 400 mol/L,Mg2+ 2.5 mol/L,Taq酶3 U,模板DNA 500 ng,引物每條0.1 mol/L,終反應(yīng)體系50 l,循環(huán)參數(shù)為: 95 10分鐘,94 60秒,63 90秒,72 60秒,10個(gè)循環(huán);94 60秒 ,61 90秒,72 60秒,25個(gè)循環(huán),72 10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa DNA Fragment Purification Kit(大連寶
8、生物公司產(chǎn)品)純化,使用循環(huán)測(cè)序試劑盒(Big Dye Terminator Cycle sequencing Kit,美國ABI公司產(chǎn)品)直接測(cè)序,測(cè)序的引物與本研究擴(kuò)增ABO基因第6、7外顯子的引物序列相同,正、反方向通測(cè),在ABI3100 DNA測(cè)序儀上檢測(cè)、SeqPOP6BDv1軟件分析結(jié)果。 HLAA、B、DRB1基因位點(diǎn)的流式磁珠反向序列特異性寡核苷酸探針法(FlowrSSO)檢測(cè) 將DNA樣本、底物、Taq酶、引物混合并混勻,加入至擴(kuò)增板中,按試劑盒(Onelambda公司產(chǎn)品)說明書中的擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增后的DNA再按操作說明書進(jìn)行雜交、染色和讀板,由Luminex100I
9、S分析軟件分析出HLAA、B、DRB1的結(jié)果。 HLAA、B、DRB1基因位點(diǎn)的聚合酶鏈反應(yīng)序列特異性引物(PCRSSP)分型法檢測(cè) 試劑由美國G&T公司提供。每一標(biāo)本反應(yīng)體系為9 l,內(nèi)對(duì)照為擴(kuò)增人類生長(zhǎng)激素(HGH)基因,目的擴(kuò)增產(chǎn)物為796 bp或429 bp,擴(kuò)增采用熱啟動(dòng)技術(shù),即95預(yù)溫5分鐘,然后95 30秒,60 30秒,72 90秒,30個(gè)循環(huán),72延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物檢測(cè)經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳20-25分鐘,紫外燈下拍照、打印照片、記錄結(jié)果。 16個(gè)短串聯(lián)重復(fù)片段(short tandem repeat, STR)位點(diǎn)熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增 結(jié) 果 血清學(xué)結(jié)果 先證者與單克隆抗A、
10、抗B血清在顯微鏡下呈混合外觀,與抗H反應(yīng)呈強(qiáng)陽性,血清與標(biāo)準(zhǔn)A細(xì)胞、B細(xì)胞無反應(yīng)。其余個(gè)體均為正常ABO血型家系,家系成員的ABO血型見圖1。 Figure 1. Schematic diagram of the inheritance of A3B3 in a family. The phenotype determined are indicated by capital letter. Arrow head indicates propositus. Sample shown in dashed square was not studied. ABO血型基因序列測(cè)定結(jié)果 與A101等位基因參考序列(GenBank注冊(cè)號(hào):AF134412)相比較,先證者為核苷酸位(nt)297A/G、646A/T,681A/G、771C/T、829A/G位有雜合,具有B基因特點(diǎn)的nt297AG,O02基因特點(diǎn)的nt646TA,681GA、771CT、8
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