植物甜蛋白馬賓靈(MabinlinⅡ)在大腸桿菌和食品級(jí)乳酸乳球菌中的表達(dá)及其活性研究

1、植物甜蛋白馬賓靈(Mabinlinn)在大腸桿菌和食品級(jí)乳酸乳球菌中的表達(dá)及其活性研究馬檳榔(CapparismasaikaiLevl.)是我國(guó)特有的、唯一的在果實(shí)中富含甜蛋白的野生植物資源，其種子中所含的甜蛋白馬賓靈(MabinlinR)的甜度是同等重量蔗糖的400倍。馬賓靈在目前已發(fā)現(xiàn)的七種植物甜蛋白中具有最佳的熱穩(wěn)定性和耐酸性,將其作為一種新型甜味劑在食品領(lǐng)域有著極為廣闊的市場(chǎng)前景。然而由于馬檳榔植物的稀缺性,無(wú)法大量獲得馬賓靈甜蛋白,限制了其在食品添加劑行業(yè)的廣泛應(yīng)用。為了擴(kuò)充馬賓靈的蛋白資源以及探討馬賓靈的活性結(jié)構(gòu)形式,本研究以基因工程手段對(duì)馬賓靈基因進(jìn)行剪切,將多種形式的重組馬賓靈

2、基因在大腸桿菌和食品級(jí)乳酸乳球菌兩種微生物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)與分離純化,并在此基礎(chǔ)上分析了重組馬賓靈的甜味活性與熱穩(wěn)定性,以期建立高純度的甜味活性馬賓靈的表達(dá)體系,為研發(fā)具備實(shí)用價(jià)值的馬賓靈新型甜味劑提供堅(jiān)實(shí)的應(yīng)用基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。本研究根據(jù)馬賓靈的甜味活性結(jié)構(gòu)特點(diǎn),按照不同表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)和后期分離純化的目標(biāo)將馬賓靈基因進(jìn)行有針對(duì)性的剪切重組。分別將重組馬賓靈導(dǎo)入大腸桿菌和食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分別建立了包涵體形式的重組馬賓靈和可溶性形式的融合重組馬賓靈的表達(dá)與分離純化體系,在食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中分別建立了重組馬賓靈的分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)的誘導(dǎo)表達(dá)體系。另外從馬檳榔種子

3、中分離純化了馬賓靈蛋白,將天然馬賓靈免疫新西蘭大白兔后經(jīng)抗原親和純化制備了馬賓靈兔源多克隆抗體。對(duì)大腸桿菌和食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)的重組馬賓靈進(jìn)行了Western-blot鑒定,并且對(duì)從大腸桿菌中分離純化的重組馬賓靈進(jìn)行了MALDI-TOF-TO分析、甜味活性分析和熱穩(wěn)定性分析。主要的研究結(jié)果如下所述：1、從馬檳榔種子中經(jīng)羧甲基纖維素層析柱分離純化活性馬賓靈,馬賓靈的提取得率和純度分別為9.82%和86.9%。采用純化的天然馬賓靈免疫新西蘭大白兔,經(jīng)抗原親和純化制備了效價(jià)比達(dá)1：256000的馬賓靈兔源多克隆抗體。Western-blot鑒定結(jié)果表明制備的構(gòu)象型馬賓靈兔源多克隆抗體

4、可特異性的識(shí)別天然和重組馬賓靈蛋白。2、三種剪切重組形式的重組馬賓靈MBL-BH、MBL-ABHf口MBL-AXBHE大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中直接表達(dá)時(shí)，均形成包涵體形式的重組馬賓靈蛋白。在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L或乳糖誘導(dǎo)濃度為10mg/mL誘導(dǎo)起始OD600為0.8、誘導(dǎo)時(shí)間為5h和誘導(dǎo)溫度為37c的條件下，誘導(dǎo)表達(dá)的三種重組馬賓靈包涵體蛋白含量最高。重組馬賓靈包涵體蛋白以2M尿素包涵體洗滌液洗滌后再經(jīng)6M鹽酸月瓜包涵體變性液變性的效果最佳。純化的變性重組馬賓靈蛋白以0.2mg/mL的濃度在復(fù)性液pH為8、復(fù)性液甘氨酸濃度為40mmol/L、復(fù)性液精氨酸濃度為300mmol/L和復(fù)性

5、液氧化還原電勢(shì)為10：1的條件下通過(guò)尿素梯度濃度稀釋復(fù)性的效果最佳。重組馬賓靈MBL-BH,MBL-ABHf口MBL-AXB經(jīng)鍥柱純化和尿素復(fù)性后，其中的可溶性重組馬賓靈的最終得率分別為1.79%、3.27%和2.76%,純度分別為85.4%、81.7%和83.5%。分離純化自大腸桿菌的重組馬賓靈MBL-BHMBL-ABHF口MBL-AXBH?Western-blot鑒定均能與馬賓靈兔源多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。重組馬賓靈MBL-BHMBL-AB即口MBL-AXB皖MALDI-TOF-TO分析鑒定為馬賓靈蛋白甜味活性分析顯示重組馬賓靈MBL-BHM有輕微舌t味感覺(jué),甜度接近于同等重量蔗糖的100

6、倍。熱穩(wěn)定性分析顯示重組馬賓靈MBL-BH勺熱穩(wěn)定性較差。3、與分子伴侶SUMO蟲(chóng)合的重組馬賓靈SUMO-MBL-BSUMO-MBL-AB大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中融合表達(dá)時(shí),兩種融合重組馬賓靈蛋白均有部分蛋白以可溶性形式存在。在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4mmol/L或乳糖誘導(dǎo)濃度為6mg/mL誘導(dǎo)起始OD60吻0.4、誘導(dǎo)時(shí)間為4h、誘導(dǎo)溫度為28c和誘導(dǎo)搖床轉(zhuǎn)速為150rpm的條件下誘導(dǎo)表達(dá)的融合重組馬賓靈可溶性蛋白含量最高?？扇苄匀诤现亟M馬賓靈蛋白經(jīng)鎳柱親和層析法純化,收集250mmol/L咪唑濃度洗脫下來(lái)的蛋白，重組融合馬賓靈SUMO-MBL-BSUMO-MBL-AB最終得率分別為3.78%和4

7、.23%,純度分別為76.3%和75.6%。分離純化自大腸桿菌的融合重組馬賓靈SUMO-MBL-BSUMO-MBL-ABWestern-blot鑒定均能與馬賓靈兔源多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。甜味活性分析顯示融合重組馬賓靈SUMO-MBL-B有輕微甜味感覺(jué)，甜度接近于同等重量蔗糖的100倍。熱穩(wěn)定性分析顯示融合重組馬賓靈SUMO-MBL-B有一定的熱穩(wěn)定性。4、重組馬賓靈MBL-B即口MBL-ABHfc食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)時(shí),培養(yǎng)基上清和菌體的可溶性蛋白中經(jīng)Western-blot可分別檢測(cè)到重組馬賓靈甜蛋白。ELISA定量結(jié)果表明，重組馬賓靈誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件為Nisin誘導(dǎo)濃度為30ng/mL、誘導(dǎo)起始OD60M0.5和誘導(dǎo)時(shí)間為3h。重組馬賓靈（MBL-BHMBL-ABH食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)的含量最高可達(dá)12.83Ng/mL和15.68仙g/mL,胞內(nèi)表達(dá)時(shí)含量最高可達(dá)22.07祖g/mL和27.19祖g/mLo本研究成功的從馬檳榔種子中分離純化了活性馬賓靈蛋,并以此制備了高效價(jià)比的兔源抗馬賓靈的多克隆抗體。首次在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分別建立了包涵體形式的重組馬賓靈和可溶性形式的融合重組馬賓靈的表達(dá)純化體系,同時(shí)也首次在食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中分別建立了分泌表達(dá)及胞內(nèi)表達(dá)重組馬賓靈的食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)體系。此外還建立了重組馬賓靈