Alzheimer病患者海馬神經(jīng)元核仁組成的研究

1、    Alzheimer病患者海馬神經(jīng)元核仁組成的研究        摘要目的間接了解Alzheimer's病(AD)海馬神經(jīng)元總體基因表達(dá)水平。方法10例AD患者病理腦海馬組織經(jīng)Nissl's染色后，像分析神經(jīng)元核仁、核漿比值，核仁組成區(qū)銀染色后像分析神經(jīng)元著色面積及積分吸光度，并與相應(yīng)的正常青年組、老年組各10例的海馬標(biāo)本進(jìn)行比較對(duì)照。結(jié)果結(jié)論Nissl's染色說(shuō)明老年人和AD患者海馬神經(jīng)元功能低下，核仁組成區(qū)銀染色提示老年人和AD患者神經(jīng)元rD

2、NA轉(zhuǎn)錄活性低下，但AD患者海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄活性相對(duì)增高，其細(xì)胞總體基因表達(dá)活性相對(duì)增強(qiáng)，此種細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化可能代表了細(xì)胞的一種防御系統(tǒng)。關(guān)鍵詞Alzheimer病核仁組成區(qū)基因 Investigation of the Nucleolar Organizer Regions in the Hippocampal Neurons of Alzheimer's DiseaseLu Wenfu, Tang Hongchuan, Fan Ming,et alDepartment of Neurology,The General Hospital of PLA (Beijing 100853

3、)AbstractObjectiveTo determine indirectly the degree of total gene expression in the hippocampal neurons of Alzheimer's disease (AD).MethodsNeuropathological examination was carried out in 10 cases of AD and control groups,including the Yang and elderly patients without any neurological disorder

4、.The nucleoli-nucleoplasm ration,stained area and intergral optical density of silver-stained nucleolar orgnizer regions (NORS) in the hippocampal neurons studied by image analysis after Nissl's and silver-stainings.ResultsThe nucleoli-nucleoplasm rations of hippocampal neurons were decreased in

5、 both of AD and elderly groups,in comparision with young group,with significant difference statistically (P<0.05 and P<0.01 respectively).There was no significant difference between the AD and elderly group (P>0.05) The stained area and intergral optical density in hippocampal neurons were

6、also reduced in the AD and elderly groups as compared with young group.But the stained area and intergral optical density of hippocampal neurons were increased more significantly in the AD group than that in the elderly group (P<0.05).ConclusionsThe results of nucleoli-nucleoplasm rations indicat

7、ed that the hippocampal neuron functions in the AD and elder were declined because of degenerative process of neurons.The results of silver-stained NoRs suggested that more active translating activity of rDNA in the AD hippocampal neurons might represent the cell defence function although the transl

8、ating activity was diminished in the AD and elderly groups.Key wordsAlzheimer diseaseNucleolar organizer regionsGeneAlzheimer病(AD)是發(fā)生在中年或老年期的一種進(jìn)行性和不可逆性神經(jīng)性變性疾病，臨床上以進(jìn)行性癡呆為主要表現(xiàn)，常伴以精神行為異常而缺乏局灶定位體征，其確診主要靠尸檢。近年來(lái)，越來(lái)越多的資料提示，基因異常可能和AD發(fā)病有關(guān)。核仁組成區(qū)(nucleolar organizer regions;NORs)是染色體上含有核糖體核糖核酸(ribosome ribonuc

9、leic acid;rRNA)基因的區(qū)段，通過(guò)銀染色方法，NORs的染色體蛋白被不同程度的染色1。銀染色的能力與核糖體基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)有相應(yīng)的關(guān)系2，3。為此，我們對(duì)AD患者海馬神經(jīng)元NORs進(jìn)行研究，以了解核仁組成區(qū)的活性，即細(xì)胞總體基因表達(dá)的活躍程度。1對(duì)象和方法1.1模型與分組病理腦海馬組織10例AD患者(男7例，女3例)嚴(yán)格按AD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，生前無(wú)任何神經(jīng)疾患，其臨床診斷進(jìn)一步由病理所證實(shí)，即相應(yīng)的年齡組內(nèi)在海馬、顳葉、額葉皮層內(nèi)出現(xiàn)大量的老年斑及神經(jīng)元纖維纏結(jié)，并和相應(yīng)的正常青年組、老年組海馬標(biāo)本各10例進(jìn)行比較、對(duì)照分析(表1)。表1AD和青年、老年患者年齡比較分組例數(shù)

10、77;st值P值青年組1030.8±7.8老年組1078.1±8.113.7<0.001*AD組1076.8±9.811.40.373<0.001*>0.05*青年組與老年組，*青年組與AD組，*老年組與AD組結(jié)果表明：老年和AD患者海馬神經(jīng)元功能狀態(tài)低下或功能紊亂，可能反應(yīng)了神經(jīng)元的退變。1.2技術(shù)方法(1)HE染色。(2)銀染色(Bodian)染色。(3)尼氏染色(甲苯胺藍(lán)法)。(4)核仁銀染：將厚10um的海馬組織石蠟切片脫水、水化，將明膠溶于1%甲酸內(nèi)配成2%溶液，將此溶液按12容積與5%硝酸銀溶液混合制成銀NORs染色工作液，將此工作液

11、滴于切片下，在20室溫下避光反應(yīng)30分鐘以上，然后用去離子水沖洗、脫水、透明、封固。(5)像分析：將制備好的玻片置于Leits顯微鏡下，用高靈敏硒化鎘攝像裝置將組織景象投身到Quantime像分析儀(英國(guó)劍橋公司)的分析熒光屏上，以指令輸入器選擇指令并共同調(diào)節(jié)顯微鏡光照度及焦距，設(shè)定檢測(cè)閾，保證灰度分離，經(jīng)2D轉(zhuǎn)換后進(jìn)行測(cè)定，每張切片隨機(jī)挑選812個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行測(cè)量，至少測(cè)量來(lái)自每組分的3個(gè)不同組織塊的切片。結(jié)果以機(jī)載Quips軟件分析處理。測(cè)量平均值表示為±s，并對(duì)青年、老年和AD三個(gè)組的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行t檢測(cè)分析。2結(jié)果2.1尼氏染色神經(jīng)元核漿比值的變化腦海馬組織切片經(jīng)尼氏染色后，神經(jīng)

12、元呈淡藍(lán)色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，分析核漿比值的變化可以了解細(xì)胞的功能狀態(tài)(表2)。表2尼氏染色三組患者神經(jīng)元核漿比值分組細(xì)胞數(shù)±st值P值青年組6060.8±5.9老年組6054.1±8.12.538<0.05*AD組6052.8±9.72.6371.976<0.01*>0.05*青年組與老年組，*青年組與AD組，*老年組與AD組2.2核仁銀染、細(xì)胞總體基因的表達(dá)核仁組成區(qū)銀染后，銀與NORs的染色體蛋白結(jié)合后成為深棕色小顆粒位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核心呈淡黃色，此方法可顯示細(xì)胞內(nèi)rDNA的轉(zhuǎn)錄活性，一般認(rèn)為可反映細(xì)胞總體基因表達(dá)的活躍程度(表3

13、，4)。表3核仁銀染三組患者神經(jīng)元核仁著色面積(m2)分組細(xì)胞數(shù)±st值P值青年組9723.82±7.04老年組7218.06±6.614.6529<0.01*AD組8121.17±5.482.352.26<0.05*青年組與老年組，*青年組與AD組，*老年組與AD組(下表相同)表4核仁銀染三組患者神經(jīng)元核仁著色的積分吸光度分組細(xì)胞數(shù)±st值P值青年組97199.79±102.96老年組72141.43±54.992.67<0.01*AD組81173.24±42.812.0392.12<0.

14、05*結(jié)果表明：和青年組相比，老年組和AD組海馬神經(jīng)元核仁著色面積減少，核仁的積分吸光度減弱。但老年組和AD組相比，AD患者海馬神經(jīng)元核仁著色面積相對(duì)擴(kuò)大，核仁積分吸光度相對(duì)增強(qiáng)，進(jìn)一步提示AD時(shí)rDNA轉(zhuǎn)錄活性區(qū)在一定程度上相對(duì)擴(kuò)大，其轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。 3討論AD的主要病理組織學(xué)表現(xiàn)為腦內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結(jié)、老年斑、神經(jīng)細(xì)胞顆?？张葑冃院虷irrano小體，其中以老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)最具有診斷意義，上述改變亦可見(jiàn)健康的老年組，但其數(shù)量不同。本組10例AD患者病程最短者3年，最長(zhǎng)者9年，除結(jié)合臨床表現(xiàn)外并經(jīng)Bodian染色符合病理診斷標(biāo)準(zhǔn)而確診4，5。對(duì)照組青年組、老年組各10例均死于內(nèi)科疾患，生

15、前無(wú)任何神經(jīng)和精神疾患之表現(xiàn)和體征。腦海馬切片經(jīng)尼氏染色后神經(jīng)元呈淡藍(lán)色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，尼氏體在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)呈大塊或呈顆粒狀。近年來(lái)用紫外顯微分光光度計(jì)測(cè)量結(jié)果證明，尼氏體的吸收光譜與RNA是一致的。在電鏡下尼氏體是一些游離的核糖體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它和神經(jīng)細(xì)胞的功能具有密切的關(guān)系，分析核漿比值的變化可以了解神經(jīng)細(xì)胞的功能狀態(tài)，本組像分析的結(jié)果說(shuō)明老年和AD患者海馬神經(jīng)元功能狀態(tài)低下的病理基礎(chǔ)。進(jìn)一步說(shuō)明老年人和AD患者隨年齡增長(zhǎng)和病程延長(zhǎng)，而逐漸出現(xiàn)細(xì)胞活性減低、功能減退，其病理基礎(chǔ)為細(xì)胞的老化、皺縮、退變、最終則發(fā)生細(xì)胞的死亡。核仁組成區(qū)(NORs)是染色體上含有rRNA基因的區(qū)段。這些基因在

16、RNA聚合酶I的參與下轉(zhuǎn)錄成rRNA前體，它們進(jìn)而被加工成rRNA6，而核仁為在細(xì)胞間期內(nèi)由于NORs中基因活動(dòng)而形成的可見(jiàn)結(jié)構(gòu)。現(xiàn)已證實(shí)，采用膠銀染色技術(shù)顯示的嗜銀物質(zhì)不是NORs本身，而是銀與NORs相關(guān)的酸性蛋白質(zhì)結(jié)合，這些蛋白質(zhì)即是核仁組成區(qū)相關(guān)AgNORs，這種結(jié)合具有高度的特異性。特殊銀染色技術(shù)可使具有轉(zhuǎn)錄活性的或已轉(zhuǎn)錄仍具轉(zhuǎn)錄活性的rDNA著色，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性的不著色7，8。故AgNORs是細(xì)胞rDNA及其轉(zhuǎn)錄水平的一種良好細(xì)胞化學(xué)標(biāo)志，AgNORs的數(shù)目可反映細(xì)胞核和細(xì)胞的活性，其面積可反映細(xì)胞總體基因的轉(zhuǎn)錄活性。我們利用這一方法對(duì)青年組、老年組和AD組海馬神經(jīng)元進(jìn)行了檢查。像分

17、析結(jié)果說(shuō)明，和青年組相比，老年組和AD組核仁著色面積減少，積分吸光度減低，提示老年組和AD組海馬神經(jīng)元rDNA轉(zhuǎn)錄活性低于青年組。Spencer9及Lezhava10在周圍血所培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞曾觀察到此種現(xiàn)象。核糖體基因活性的減少可能是由于rDNA基因在調(diào)節(jié)和表達(dá)方面的變化而引起蛋白質(zhì)合成的減少。但有趣的是老年組和AD組比較，其核仁著色面積相對(duì)擴(kuò)大，積分吸光密度相對(duì)增強(qiáng)，提示AD患者海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄活性相對(duì)增高，其細(xì)胞總體基因表達(dá)活性相對(duì)增強(qiáng)，有些作者在AD患者腦皮層觀察到一些形態(tài)學(xué)的變化，和對(duì)照組比較：神經(jīng)元樹(shù)突脊在數(shù)量上增多，大小上增加；膽堿能纖維則延長(zhǎng)曲張，提示此調(diào)節(jié)代償現(xiàn)象在人類可能比較發(fā)

18、達(dá)，因此，海馬神經(jīng)元基因表達(dá)活性增強(qiáng)可能代表了一種細(xì)胞的防御系統(tǒng)。總之，AD神經(jīng)元這些形態(tài)學(xué)上的變化可能是由于海馬神經(jīng)元的患病階段或由于病理過(guò)程中仍然存活而沒(méi)有影響的神經(jīng)元的代償機(jī)制所致。作者單位：盧文甫王魯寧（解放軍總醫(yī)院腦系科100853）范明米瑞發(fā)（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所）參考文獻(xiàn)1Howel WM,Black DA.Controlled silver-staining of neucleolus organizers refions with a protective colloidal developer a 1-step method.Experimentia,1980,36:101

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20、 of the MINCDS-ADRDA work group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease.Neurology,1984,34:9395Richard L D,David MR.Textbook of Neuropathology In:Degenerative diseases of the central nervous system,Pathologic diagnosis of Alzheimer's disease,second.Baltimore.Hong Kong.London.Munich San Francisco.Sydney.Tokyo:Williams and Willins,1991,904-9186Crocker J and Nar P.Nucleolar organizer regions in lymphomas.J