CCKB-R mRNA在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)

1、CCKB-R mRNA在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中的表達(dá) 作者：趙瓊 廖敏 丁維俊 李秀亮 瞿佳【摘要】 目的探討膽囊收縮素受體CCKB-R mRNA在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)及加減益胃湯對(duì)其表達(dá)的影響。方法借助特制飼料喂養(yǎng)幼齡厭食大鼠模型，采用RT-PCR技術(shù)檢測CCKB-R在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)，并觀察加減益胃湯對(duì)該模型CCKB-R表達(dá)的影響。結(jié)果正常大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中CCKB-R有低水平表達(dá)，特制飼料喂養(yǎng)造模后其表達(dá)水平異常增高，與空白對(duì)照組比較有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.001）；加減益胃湯高、中、低劑量組均能顯著抑制或下調(diào)CCKB-R的高表達(dá)，且有一定的量

2、-效趨勢。結(jié)論CCKB-R基因高表達(dá)可能是厭食發(fā)生的主要病理環(huán)節(jié)之一，抑制或下調(diào)CCKB-R基因表達(dá)可能是加減益胃湯厭食癥的主要作用靶點(diǎn)之一。 【關(guān)鍵詞】 膽囊收縮素受體；厭食Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats, and the effect of modified Yi Wei Decoction on it.MethodsThe anorexia rat model was establisb

3、ed by feeding rats with specially prepared forage. The expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats was examined by RT-PCR, and the effect of modified Yiwei decoction on it was observed.ResultsCompared with blank control, the expression of CCKB-R mRNA in anorexia

4、rats was significantly increased (P0.001). Highdosage, middledosage or lowdosage of Yiwei decoction all could obviously decrease the expression of CCKB-R mRNA as compared with model group(P0.001).ConclusionThe expression of CCKB-R mRNA can be obviously increased in colon smooth muscle cells of the a

5、norexia pedo-rats, which is one of the mechanisms of anorexia.Modified Yiwei decoction can decrease the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia rats.Key words：CCKB-R; Anorexia 近年來研究證實(shí)膽囊收縮素（CCK）等腦腸肽在小兒厭食癥的發(fā)病中起著重要的作用，但對(duì)其受體表達(dá)及進(jìn)一步的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還不十分清楚。本研究在近年來中藥復(fù)方加減益胃湯治療小兒厭食癥取得良好

6、臨床療效和我們前期研究1的基礎(chǔ)上，借助特制飼料喂養(yǎng)幼齡厭食大鼠模型，對(duì)CCKB-R在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)及加減益胃湯對(duì)其表達(dá)的影響進(jìn)行了初步研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。1 材料與儀器2 方法2.1 分組及造模2.2 樣本提取與保存大鼠處死后，迅速剪取結(jié)腸中段, 生理鹽水洗盡血跡，去除黏膜層, 取肌層組織并置于液氮中保存待測。2.3 RTPCR檢測CCKB-R表達(dá)從美國國立衛(wèi)生院所維護(hù)的國際權(quán)威數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站獲得最新版本的CCKB-R和內(nèi)參基因-actin的mRNA序列。利用引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)其引物。然后委托大連寶生物完成引物合成。將引物溶于去離子水之中，終

7、濃度調(diào)整為20 pmol/l，20保存?zhèn)溆谩CKB受體引物：5-CTAAGAACGGTCACCAACG；3-GTGTAAGTAGAAGCCGTG。采用美國TriZol試劑(Cat NO: 15596-018)，按試劑盒提供的方法提取結(jié)腸中段組織中的總RNA，各組使用相同劑量的結(jié)腸中段組織總RNA。1.5%瓊脂糖電泳確定質(zhì)量與含量后，80保存?zhèn)溆谩? 按試劑盒說明程序進(jìn)行，先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)合成cDNA。PCR儀進(jìn)行CCKB-R擴(kuò)增，取10 l cDNA反應(yīng)液進(jìn)行PCR。PCR的條件：變性：94預(yù)變性5 min，94變性1 min；退火：54，30 s；延伸72，30 s。30個(gè)循環(huán)后，72再延

8、伸10 min終止反應(yīng)，4。CCKB-R PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳（電壓100 V，時(shí)間30 min），取出后于紫外線下觀察，利用凝膠成像系統(tǒng)分別測定擴(kuò)增條帶的積分光密度值。比較各組CCKB-R相對(duì)光密度值并進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)，判定CCKB-R mRNA在幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)及加減益胃湯對(duì)其表達(dá)的影響。2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SAS 軟件包處理，計(jì)量資料均以s表示。多組資料比較用方差分析，兩組資料比較用t檢驗(yàn)。3 結(jié)果 見表1。表1 實(shí)驗(yàn)各組對(duì)幼齡厭食大鼠結(jié)腸平滑肌組織CCKB-R mRNA表達(dá)的影響（略）表1所示，模型組CCKB-R mRNA表達(dá)與空白組比較有顯著差異（P0.

9、001）；與模型組比較，陽性藥組、加減益胃湯高劑量組、中劑量組、低劑量組均使結(jié)腸平滑肌組織CCKB-R mRNA表達(dá)下調(diào)（P0.001）；與陽性藥組比較，加減益胃湯各組下調(diào)CCKB-R mRNA表達(dá)程度高于陽性藥組，但差異不顯著；加減益胃湯各組間比較無顯著性差異（P0.05），但下調(diào)CCKB-R mRNA表達(dá)水平表現(xiàn)為高劑量組中劑量組低劑量組，有一定量-效關(guān)系趨勢。4 討論 膽囊收縮素（cholecystokinion, CCK）是一種廣泛分布于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的典型的腦腸肽，具有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)、消化液分泌、攝食、情緒、記憶等多種生理功能。研究結(jié)果已證實(shí)，小兒厭食癥的臨床表現(xiàn)與八肽膽囊收縮素（

10、CCK-8）等腦腸肽水平和胃腸運(yùn)動(dòng)功能狀態(tài)有著密切的關(guān)系。報(bào)道“病因模擬”厭食模型鼠中樞和外周CCK-8均顯著增高3，但CCK受體在厭食癥發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚不十分清楚。 CCK對(duì)胃竇、幽門、小腸、膽囊平滑肌細(xì)胞有收縮作用，能增強(qiáng)膽囊收縮和小腸結(jié)腸的動(dòng)力，且通過其受體及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其生理作用。通常認(rèn)為CCK與胃腸平滑肌細(xì)胞膜上的CCK-B受體結(jié)合后使G蛋白活化，激活膜上的磷脂酶C（PLC）信號(hào)級(jí)聯(lián)，通過Ca2+-CaM途徑產(chǎn)生胃腸平滑肌細(xì)胞收縮。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)研究中幼齡厭食大鼠模型結(jié)腸CCK-B受體基因較空白組表達(dá)顯著增高(P0.05), 提示幼齡厭食大鼠模型結(jié)腸CCK耦聯(lián)Ca2+-CaM

11、信號(hào)通過高度活化，受體上調(diào)，使胃腸平滑肌收縮增強(qiáng)。然而近年的研究表明，CCK 對(duì)進(jìn)食后的胃排空有抑制作用。Wechsung 等4研究發(fā)現(xiàn),CCK通過舒張近端胃和提高幽門括約肌張力以及改變胃排空模式對(duì)胃排空發(fā)揮抑制作用。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，即使是膽囊平滑肌收縮“正?！钡哪懩医Y(jié)石患者,其CCK 受體mRNA 表達(dá)亦顯著低于正常人5。因此本實(shí)驗(yàn)特制飼料喂養(yǎng)幼齡大鼠后CCK受體表達(dá)上調(diào)，可能使胃腸平滑肌收縮異常，平滑肌處于緊張或痙攣狀態(tài)，胃排空抑制，胃腸運(yùn)動(dòng)減弱，排空減慢，進(jìn)而產(chǎn)生飽脹感、厭食等。而加減益胃湯通過下調(diào)胃腸CCK-B受體基因表達(dá)，使高表達(dá)的CCK-B受體恢復(fù)正常，胃腸平滑肌緊張或痙攣狀態(tài)緩解，

12、胃腸運(yùn)動(dòng)恢復(fù)正常，從而達(dá)到厭食的目的。 我們推測，由于CCK-8對(duì)攝食的控制有兩種作用方式，一是腦組織分泌的CCK-8的中樞作用，二是腹迷走神經(jīng)傳入纖維介導(dǎo)的外周CCK-8的作用。而CCK 對(duì)消化管運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)有神經(jīng)介導(dǎo)和直接作用于平滑肌兩種途徑。CCK 直接作用于平滑肌, 因需較高濃度的CCK, 故認(rèn)為只有較低的親和力。CCK 對(duì)消化管的調(diào)節(jié)被認(rèn)為主要是以高親和力的神經(jīng)調(diào)節(jié)為主。因此，CCK對(duì)胃腸道平滑肌的作用主要依靠的是神經(jīng)調(diào)節(jié)。但由于生理狀態(tài)下體內(nèi)CCK 的作用濃度還不清楚，其他激素、神經(jīng)遞質(zhì)等與CCK在厭食發(fā)生中的相互作用影響又是怎樣的，CCK受體在厭食癥發(fā)病中的具體作用機(jī)制還需要我們進(jìn)一步深入研究和探討?！疚墨I(xiàn)】 1趙瓊，徐世軍，崔敏俐.加減益胃湯治療小兒脾胃陰虛厭食癥的實(shí)驗(yàn)研究J.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,28（3）：15.2汪受傳,張?jiān)缕?特制飼料喂養(yǎng)幼齡大鼠建立小兒厭食模型J.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，15（3）：148.3彭玉,吳高鑫.運(yùn)脾散對(duì)厭食大鼠下丘腦和血漿CCK8的調(diào)節(jié)作用J.中醫(yī)兒科雜志，2007，3(2):20.4Wechsung E, Houvenag