粗多糖含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證(范本)

1、粗多糖含量測(cè)定方法學(xué)研究資料一、儀器與試藥1二、方法的研究11.檢測(cè)波長(zhǎng)的測(cè)定22.樣品及對(duì)照制備方法2三、方法學(xué)驗(yàn)證31.線性32.精密度實(shí)驗(yàn)43.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)44.重復(fù)性試驗(yàn)45.重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)56.準(zhǔn)確度試驗(yàn)5芪參顆粒粗多糖含量測(cè)定方法起草說(shuō)明標(biāo)志性成分粗多糖含量測(cè)定的方法來(lái)源于保健食品功效成分檢測(cè)方法白鴻主編（中國(guó)中醫(yī)藥出版社)的第二法，該方法的原理是：多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后，去除其他可溶性糖及雜質(zhì)的干擾，糖與硫酸在沸水浴中加熱脫水生成羥甲基呋喃甲醛（羥甲基呋喃糠醛），再與蒽酮縮合成藍(lán)綠色化合物，其顯色強(qiáng)度與溶液中糖的濃度成正比，在625nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。主要研究資料如下：一、儀器與試藥1、

2、儀器(1) 離心機(jī)（湘南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)TD25-WS）；(2) 離心管：50ml；(3) 水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào) DK-S26）；(4) 旋渦混合器（DioCote，SA8）；(5) SHIMADZU UV-1800 紫外可見光分光光度計(jì)；(6) JB760-68 石英比色皿 （宜興市偉鑫儀器有限公司）；(7) TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；2、試藥(1) 葡萄糖：廣州化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)為20110602-1；(2) 無(wú)水乙醇：西隴化學(xué)股份有限公司，分析純，批號(hào)為160802 1；(3) 蒽酮：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試

3、劑有限公司，分析純，批號(hào)為20131127；(4) 硫酸：廣州化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)為20150404-1；(5) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：標(biāo)準(zhǔn)稱取干燥恒重的分析純級(jí)葡萄糖0.5000g，加水溶解，并定容至50ml，此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀釋100倍為使用液（0.1mg/ml）。(6) 0.1%蒽酮硫酸溶液（W/V）：準(zhǔn)確稱取0.1g蒽酮置于燒杯中，緩緩加入100ml 80%硫酸溶解，溶解后呈黃色透明溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。3、試樣(1) 樣品顆粒：XXXXX有限公司提供。二、方法的研究粗多糖含量測(cè)定的方法來(lái)源于保健食品功效成分檢測(cè)方法白鴻主編（中國(guó)中醫(yī)藥出版社)的第二法，本研究針對(duì)葡萄糖對(duì)照以及

4、樣品的的吸光度進(jìn)行檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定，如下所示：1.檢測(cè)波長(zhǎng)的測(cè)定取葡萄糖對(duì)照品溶液、樣品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示對(duì)照品和樣品均在625nm波長(zhǎng)附近有最大吸收。序號(hào)波長(zhǎng)吸光度1625.000.3602509.500.2713422.500.262序號(hào)波長(zhǎng)吸光度1760.000.0552624.500.154芪參顆粒樣品溶液紫外波長(zhǎng)吸收?qǐng)D葡萄糖對(duì)照品紫外波長(zhǎng)吸收?qǐng)D2.樣品及對(duì)照制備方法（1）樣品提?。悍Q取混合均勻的固體樣品2.0g，置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴中加熱1小時(shí)，冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度（V1），混勻后過(guò)濾，棄去初濾液，收集余下濾液供沉淀粗多糖。（2）沉淀粗多糖：

5、準(zhǔn)確吸取上濾液（或液體樣品）5.0ml（V2），置于50ml離心管中（或2.0ml于15ml具塞離心管中），加入無(wú)水乙醇20ml（或8ml），混勻，于4冰箱靜置4小時(shí)以上，以4000r/min離心5min，棄去上清液，殘?jiān)?0%（V/V）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次。殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?0ml（V3）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2ml（相當(dāng)于葡萄糖0mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg、0.12mg）置于10ml比色管中，補(bǔ)加水2.

6、0ml，加入0.1%蒽酮硫酸溶液6ml，在旋渦混合器上混勻，置沸水浴中加熱10min，取出，在流水中冷卻20min后，用分光光度計(jì)在625nm波長(zhǎng)處以試劑空白為參比，1cm比色皿測(cè)定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取樣品待測(cè)液2.0ml（含糖量20100g），按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟于625nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值并求出樣品含量。三、方法學(xué)驗(yàn)證1.線性取適量葡萄糖對(duì)照品，精密稱定，加水制成0.1094mg/ml的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2m

7、l，置于10ml比色管中，補(bǔ)加水2.0ml，依法測(cè)定。得標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液。依法測(cè)定，分別制成含葡萄糖為0、21.88g、43.76g、65.44g、87.52g、109.40g、131.28g的溶液，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，葡糖糖對(duì)照品的含量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見下圖，其回歸方程為： y=0.00507x+0.0048（r=0.99989），試驗(yàn)表明葡萄糖對(duì)照品在0131.28g范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。見表1。表1 線性考察結(jié)果含量（g）021.8843.7665.4487.52109.40131.28吸光度（Y） -0.0007 0.1111 0.2209 0.3372 0.4431

8、0.55610.6635回歸方程 y=0.00507x+0.0048 r=0.9999粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：粗多糖對(duì)照在0131.28g內(nèi)成良好的線性關(guān)系。2.精密度實(shí)驗(yàn)取一供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，記錄吸光度，結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果RSD2.0（RSD0.44，n6），說(shuō)明儀器精密度良好。表2 儀器精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果序號(hào)吸光度平均吸光度RSD10.33980.34180.4420.341430.340740.343550.343660.34193.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品，按以下時(shí)間測(cè)定，記錄吸光度，結(jié)果見表3。表3 粗多糖穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果時(shí)間0min30min1h2h3h4h吸光度0.3437 0.

9、3409 0.3397 0.3370 0.3342 03313 1hRSD(%)0.602hRSD(%)0.82 4hRSD(%)1.35 結(jié)果表明供試品溶液在顯色反應(yīng)完成后4小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。4.重復(fù)性試驗(yàn)取同一供試品，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，并按樣品及對(duì)照制備方法測(cè)定粗多糖含量，結(jié)果見表4。表4 粗多糖重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（單位：mg/100g）樣品編號(hào)123456含量(mg/100ml)348343335330335338平均含量338RSD（%）1.91結(jié)果表明6份供試品溶液按照粗多糖的檢測(cè)方法測(cè)定重復(fù)性好。5.中間精密度實(shí)驗(yàn)取同一供試品(批號(hào)：150401)，由另一操作者于不同時(shí)

10、間、不同儀器操作，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，并按樣品及對(duì)照制備方法測(cè)定粗多糖含量，結(jié)果見表5。表5 粗多糖中間精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（單位：mg/100g）標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果：含量（g）020.3240.6460.9681.28101.6121.92吸光度（Y） 0 0.098 0.196 0.296 0.394 0.506 0.575回歸方程 y=0.0048x+0.0015 r=0.9992樣品測(cè)定結(jié)果：樣品編號(hào)123456含量(mg/100ml)294285297273297287平均含量289RSD（%）3.20結(jié)果表明6份供試品溶液按照粗多糖的檢測(cè)方法測(cè)定進(jìn)行的中間精密度實(shí)驗(yàn)精密度良

11、好。6.準(zhǔn)確度試驗(yàn)采用加樣回收法，精密稱取本品（批號(hào)：150401，平均含量：338mg/100g，平均吸光度：0.3449）2.0g各6份，按照樣品及對(duì)照制備方法中制備得樣品待測(cè)液6份，分別從6份待測(cè)液中吸取1ml置于10ml比色皿中，再分別精密加入1ml 100%濃度的對(duì)照品溶液（濃度：0.03402mg/ml），依法進(jìn)行測(cè)定，記錄吸光度，以吸光度計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。6份樣品回收率均在95%105%之間，平均回收率為103%，RSD=0.78%，該方法準(zhǔn)確度符合要求。表6 粗多糖回收率試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)取樣量 (g)樣品吸光度 對(duì)照品加入量對(duì)照加入對(duì)照后回收率平均值（%）RSD（mg）測(cè)得吸光度總吸光度（%）（%）12.0027 0.1724 0.03402 0.1688 0.3441102 103 0.78 22.0030 0.17