實驗三植物光合與呼吸速率的測定

1、實 驗 植物光合與呼吸速率的測定紅外線CO2吸收法一、實驗?zāi)康墓夂献饔檬堑厍蛏献钪匾纳F(xiàn)象，它是唯一能把太陽能轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化學能貯藏在有機物中的過程，是維持地球上物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是農(nóng)作物產(chǎn)量形成的決定性因素。在植物科學研究中，經(jīng)常需要測定光合作用。在光合作用（及呼吸作用）測定方法的發(fā)展過程中，曾經(jīng)有過多次革新，其中包括測定干物質(zhì)積累的稱重法，測定CO2吸收（和釋放）的滴定法，測氧氣釋放的檢壓法和氧電極法等。與這些方法相比，紅外線氣體分析儀堪稱較先進的方法。它不但快速、準確，而且可將測定信號變?yōu)殡娦盘栞敵?，便于儀器的自動化和智能化。一、實驗原理紅外線CO2氣體分析儀（IRGA）工作原理

2、：當紅外光經(jīng)過含有CO2的氣體時，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少與CO2的濃度有關(guān)，并服從朗伯比爾定律。即紅外線經(jīng)過 CO 2氣體分子時，其輻射能量減少，被吸收的紅外線輻射能量的多少與該氣體的吸收系數(shù)（ K ）、氣體濃度（ C）和氣體層的厚度（ L ）有關(guān)，可以用下式表示： E = E 0 e -KCL 式中： E 0：入射紅外線的輻射能量； E：透過的紅外線的輻射能量。一般紅外線 CO 2 氣體分析儀內(nèi)設(shè)置僅讓 4.26m 紅外線通過的濾光片，其輻射能量即 E 0 ，只要測得透過的紅外線輻射能量（ E ）的大小，即可知 CO 2 氣體濃度。本實驗中：IRGA 是測定 CO 2 濃度的

3、專用儀器，不能直接測定植物葉片的光合速率，必須根據(jù) IRGA的性能和測定目的，將 IRGA與同化室組成一定的氣路系統(tǒng)，才能進行葉片光合速率的測定。常用的氣路系統(tǒng)有密閉式和開放式兩種（本實驗采用密閉式）。 1、密閉式氣路系統(tǒng)：被測植物或葉片密閉在同化室中，不與同化室外發(fā)生任何的氣體交換，同化室內(nèi)的 CO 2濃度因光合作用而下降，或由呼吸作用而上升，可用 IRGA 測定同化室內(nèi) CO 2 濃度的下降值或上升，計算光合速率或呼吸速率。二、儀器 GXH-3051紅外線CO2氣體分析儀 氣泵開關(guān)電源開關(guān)調(diào)零旋鈕調(diào)零測量轉(zhuǎn)換旋鈕進氣口出氣口圖3-3-1、GXH-3051紅外線CO2氣體分析儀閉路光合的工作

4、原理為：由兩根氣路管在葉室和紅外線CO2分析儀之間連通形成回路進行氣體的循環(huán)，在葉片的光合作用吸收CO2放出O2的過程中達到對CO2濃度降低的測量，從而計算出植物光合作用速率等數(shù)據(jù)。原理圖如下：顯示與調(diào)節(jié)葉 室紅外線分析儀氣體輸入氣體輸出光照圖 閉路光合的工作原理圖 開路光合的工作原理為，由單根導氣管在紅外線CO2分析儀與葉室之間連通，形成開路。在開路光合測量時，通入的氣體濃度必須是已知的（如P1=500ppm），當數(shù)據(jù)采集完成后，讀出的數(shù)據(jù)（設(shè)為P2），那么由儀器讀數(shù)在光合作用前后的變化值就是植物光合作用所吸收的CO2的量（設(shè)為P光合）。即： P光合=P1-P2開路光合的光合速率測定公式為：

5、 式中各字母代表的參數(shù)與閉路光合時一樣，F(xiàn)代表氣體流量。工作原理圖如下穩(wěn)定氣源輸入葉 室顯示與調(diào)節(jié)紅外線 分析儀氣體輸出光照圖 開路光合測量工作原理圖 三、實驗材料甜菜和丁香等植物的葉片（活體）。四、實驗步驟1、 按儀器使用說明書要求將氣路系統(tǒng)的各部分連接起來，打開氣室。2、 接通電源，打開紅外儀電源預(yù)熱15min，表頭顯示的數(shù)據(jù)為殘留在樣品室中的CO2的氣體濃度值。預(yù)熱過程中氣泵開關(guān)應(yīng)處在關(guān)閉的位置上。3、將儀器后面板的切換閥旋到左側(cè)的調(diào)零位置上，打開氣泵電源，約1min后，數(shù)顯表頭的顯示值趨向零點附近，調(diào)節(jié)紅外儀前面板“調(diào)零”旋鈕，顯示在“零點”位置。4、跨度校準：關(guān)上氣泵的開關(guān)，將儀器后

6、面板的切換閥旋到右側(cè)的測量位置上，將標準氣以1.2L/min的流量與儀器的“進氣口”相連，使標準氣通入儀器內(nèi)，約1min左右，待顯示值穩(wěn)定以后，旋下跨度電位器上的保護蓋，調(diào)節(jié)跨度旋鈕使顯示CO2濃度與標氣濃度一致。5、 將待測葉片放入同化室（氣室），密閉后當CO2濃度穩(wěn)定下降時，開始測定，讀取開始的CO2濃度值C1，開始計時，CO2下降至C2（約下降2030ppm），終止計時，記錄C1、C2、t（或確定從測定開始到結(jié)束所需時間），測定結(jié)束后測量葉片的面積（氣室面積）。6、 計算凈光合速率： 上式中，Pn光合速率（單位mol·m2·s1）；CCO2濃度落差C1-C2（ppm：

7、uL/L）；t測定時間（S）；S葉片面積（單位m2）；V同化室（包括氣路系統(tǒng)）體積（單位L：0.07L）；t同化室的溫度；P大氣壓（單位Mpa）。系統(tǒng)容積是閉路光合中很重要的一項參數(shù)。它的值包括了葉室體積、氣路管容積和紅外線分析儀里氣室容積的總合，即V系統(tǒng)容積=V葉室體積+V氣路管容積+V分析儀氣室容積該儀器的系統(tǒng)容積為0.07L。7、呼吸速率測定：葉室用遮光布（由紅、白、黑布疊縫而成）遮光。方法同上。 表1-1 植物光合速率呼吸速率測定記錄表植物材料葉片面積(m2)同化室體積V(L)同化室溫度t ()大氣壓P (Mpa)測定時間t（S）CO2濃度落差C（ppm：uL/L）0.07L光合速率P

8、n（mol·m2·s1）呼吸速率（mol·m2·s1）五、注意事項1、密閉系統(tǒng)的最基本要求是嚴格密閉，不能漏氣，否則無法測定。 2、紅外儀的濾光效果并不十分理想，水蒸氣是干擾測定的主要因素，因此，取樣器干燥管內(nèi)的 CaCl2要經(jīng)常更換，避免吸水溶解進入紅外儀，污染分析氣室，以保證測量精度，延長儀器壽命。3、實驗期間，儀器使用后請立即充電，以確保后續(xù)實驗正常進行。實驗四 植物體過氧化物酶的測定一、實驗?zāi)康模赫莆沼糜鷦?chuàng)木酚法測定過氧化物酶活性的方法。二、實驗原理：過氧化物酶廣泛頒布于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶

9、褐色物質(zhì)，可用分光光度計測量生成物的含量。三、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備1、實驗儀器722型分光光度計、離心機、秒表、電子天平、研缽2、實驗試劑愈創(chuàng)木酚、30%過氧化氫、20 mmol/L KH2PO4、100 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)、反應(yīng)混合液100 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0) 50mL，加入愈創(chuàng)木酚28uL，加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19uL，混合均勻保存于冰箱中。3、實驗材料任何植物材料四、實驗步驟1、粗酶液的提取稱取植物(小麥葉片)材料0.1g，加20mmol/L KH2PO4 5mL，于研缽中研磨成勻漿，以10000r/min離心10分鐘，收集上清液保存在冷處，所得殘渣再用20mmol/L KH2PO4 5mL溶液提取一次，合并兩次上清液。2、酶活性的測定取比色皿2只，于一只中加入反應(yīng)混合液3mL，KH2PO4 1mL，作為校零對照，另一只中加入反應(yīng)混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性過高可適當稀釋)，立即開啟秒表，于分光光度計470nm波長下測量OD值，每隔30s讀數(shù)一次。以每分鐘表示酶活性大小，即以O(shè)D470/min.mg蛋白質(zhì)表示，蛋白質(zhì)含量測定按Folin法進行。五、結(jié)果計算以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min.g(鮮重)表