醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)試題答案

1、名詞解釋：基因是核酸中貯存遺傳信息的遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA 序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列。基因組（gencme）:細(xì)胞或生物中，一套完整單倍體遺傳物質(zhì)的總和（包括一種生物所需的 全套基因及間隔序列）稱為基因組?；蚪M的功能是貯存和表達(dá)遺傳信息。SD 序列（Shine-Dalgarno sequence,SD sequenee）是 mRNA 能在細(xì)菌核糖體上產(chǎn)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn) 譯所需要的序列。SD 序列與 16S rRNA 的 3末端堿基（AUUCCUCCAC-UAG-5 ）互補(bǔ)，以控制轉(zhuǎn) 譯的起始分子克隆：克隆（clone）：是指單細(xì)胞純系無性繁殖，現(xiàn)代概念

2、是將實(shí)驗(yàn)得到的人們所需的 微量基因結(jié)構(gòu)， 引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中去， 在合適的生理環(huán)境中進(jìn)行無性繁殖， 從而利用宿 主的生理機(jī)制繁衍人們所需要的基因結(jié)構(gòu)， 并進(jìn)行表達(dá)。 由于整個(gè)操作在分子水平上進(jìn)行， 所以稱為 分子克隆 （molecularcloning ）。動(dòng)物克隆 （Animal cloning） 就是不經(jīng)過受精過程而獲得動(dòng)物新個(gè)體的方法 .基因診斷 ：就是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)（DNA 水平）及其表達(dá)水平（RNA 水平）是否正常，從而對(duì)疾病做出診斷的方法。基因治療 就是將有功能的基因轉(zhuǎn)移到病人的細(xì)胞中以糾正或置換致病基因的一種治療方法， 是指有功能的目

3、的基因?qū)氚屑?xì)胞后有的可與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物起到對(duì)疾病的治療作用。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 就是把外源性目的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵或其囊胚細(xì)胞中，并在細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細(xì)胞篩選出來，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動(dòng)物（foster mother ）的子宮內(nèi)，使之發(fā)育成具有表達(dá)目的基因的胚胎動(dòng)物，并能傳給下一代。 這樣，生育的動(dòng)物為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。探針： 在核酸雜交分析過程中，常將已知順序的核酸片段用放射性同位素或生物素進(jìn)行標(biāo) 記。這種帶有一定標(biāo)記的已知順序的核酸片段稱為探針 。限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶 （restrictio

4、n endonuclease ）是一類專門切割 DNA 的酶， 它們能特異結(jié)合一段被稱為限制酶識(shí)別順序的特殊DNA 序列并切割 dsDNA。載體： 要把一個(gè)有用的基因（目的基因-研究或應(yīng)用基因）通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞） ，需要運(yùn)載工具攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（ vector ）。限制性片段長(zhǎng)度多肽性分析（RFLP）:DNA 片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment lengthpolymer-phism,RFLP） 基因突變導(dǎo)致的基因堿基組成或（和）順序發(fā)生改變 ,會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或使原有的位點(diǎn)消失 . 用限制酶

5、對(duì)不同個(gè)體基因組進(jìn)行消化時(shí)， 其 電泳條帶的數(shù)目和大小就會(huì)產(chǎn)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷出突變是否存在。簡(jiǎn)答題：1.蛋白質(zhì)的生物合成過程中的成分參與，參與因子，作用 mRNA 是合成蛋白質(zhì)的“藍(lán)圖（或模板）”tRNA 是原料氨基酸的“搬運(yùn)工”rRNA 與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體作為合成多肽鏈的裝配機(jī)（操作臺(tái)）tRNAmRNA 是合成蛋白質(zhì)的藍(lán)圖，核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠，但是，合成蛋白質(zhì)的原料一一20種氨基酸與 mRNA 的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，需要轉(zhuǎn)運(yùn)RNA 把把氨基酸搬運(yùn)到核糖體中的 mRNA 上rRNA核糖體 RNA（ rRNA）和蛋白質(zhì)共同組成的復(fù)合體就是核糖體，核糖體是蛋白質(zhì)

6、合成的場(chǎng)所。 核糖體的大小亞基在行使翻譯功能即肽鏈合成時(shí)聚合成整體，為蛋白質(zhì)的合成提供場(chǎng)所。mRNA攜帶遺傳信息，在蛋白質(zhì)合成時(shí)充當(dāng)模板的RNA。從脫氧核糖核酸（DNA）轉(zhuǎn)錄合成的帶有遺傳信息的一類單鏈核糖核酸（RNA）。它在核糖體上作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定肽鏈的氨基酸排列順序。核糖體：容納 mRNA,并能沿著 mRNA 由 5 3移動(dòng)，由 tRNA 解讀其密碼；氨基酰位點(diǎn)（A 位點(diǎn)）， 可結(jié)合氨基酰-tRNA（AA-tRNA）；肽?；稽c(diǎn)（P 位點(diǎn)），可結(jié)合肽?；?tRNA （肽-tRNA）; 肽?；D(zhuǎn)移酶中心，是形成肽鍵的位點(diǎn)等。起始因子（IF）:翻譯起始所需要的催化性蛋白質(zhì)。促使核糖體

7、和mRNA 正確結(jié)合延伸因子（EF）:蛋白質(zhì)合成過程，幫助進(jìn)入的氨基酸殘基與肽鏈之間形成?；?，使肽鏈得 以延長(zhǎng)的一類蛋白質(zhì)因子。釋放因子（RF）：識(shí)別終止密碼子引起完整的肽鏈和核糖體從mRNA 上釋放的蛋白質(zhì)翻譯起始時(shí)，第一個(gè)氨基酸一般是蛋氨酸，其氨基要甲?；?，予以保護(hù)。氨基酰tRNA 進(jìn)入 A位肽鍵的形成蛋白質(zhì)合成的終止肽鏈的延伸2核酸技術(shù)（1）PCF 技術(shù)的基本原理：PCF 技術(shù)在模板 DNA、dNTP、Mg2+、合適 Buffer 等條件下，用耐熱的 Taq 聚合酶代替 DNA 聚合 酶，用合成的 DNA 引物代替 RNA 引物，經(jīng)過 DNA 變性、弓 I 物與模板結(jié)合（復(fù)性）和延伸 3

8、 個(gè)步 驟的反復(fù)循環(huán)（2530 次）過程，使目的 DNA 呈指數(shù)擴(kuò)增。DNA 模板的熱變性：將待擴(kuò)增 DNA 加熱到 94C左右，使雙鏈 DNA 解開成為單鏈，并 游離于反應(yīng)體系中作為模板。模板與引物的結(jié)合（退火或復(fù)性）：將體系溫度降至合適溫度（52C左右），使加 入的引物與模板 DNA兩端（3/端）堿基序列互補(bǔ)結(jié)合。引物延伸：將體系溫度升到 72C左右，Taq 聚合酶催化 dNTP 按堿基互補(bǔ)原則連接在DNA 引物 3/端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補(bǔ)的新鏈。參數(shù)變性溫度與時(shí)間：一般選擇：94C,30 秒退火溫度與時(shí)間：取決于引物長(zhǎng)度、濃度和G+C 含量，一般選擇為 Tm - 5C延伸溫度與

9、時(shí)間：一般選擇：70C75C循環(huán)次數(shù)：取決于模板濃度，一般循環(huán)：30 次引物是根據(jù)已知序列的模板 DNA 待擴(kuò)增區(qū)兩端而設(shè)計(jì)的一對(duì)寡核苷酸小片斷，長(zhǎng)度一般為 1530 個(gè)堿基。RNA 乍為模板時(shí)，需要： RNA cDNA PCR，稱此為 RT-PCR（2）Southem 印跡雜交法（Southern blot hybridization）又稱為 Southern 雜交，即 DNA-DNA 雜交分析。是研究 DNA 圖譜的基本技術(shù)，主要用于基因組 DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等，亦可用于分析重組質(zhì)粒和噬菌體。在 遺傳診斷 DNA圖譜分析及 PCR 產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。提取

10、DNAT限制性內(nèi)切酶酶切T瓊脂糖凝膠電泳TDNA 用堿變性T變性的 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜T加入 DNA 探針T顯影或顯色檢測(cè)雜交信號(hào)T證實(shí)DNA 靶分子是否含有目的基因片段。Northem 印跡雜交法（Northern blot hybridization）又稱為 Northern 雜交，即 RNA-DNA 雜交分析。是一種將 RNA 從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維 素膜上的方法。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA 的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。（1） 檢測(cè) mRNA 長(zhǎng)度分子量大小（依電泳遷移率估計(jì)） ;（2） mRNA 的含量，即基因表達(dá)高低。（密度

11、掃描儀，定量分析）Northern 雜交用于鑒定 RNA。其基本原理與 Southern 雜交相同，只不過變件方法不能采用堿 變性法，因?yàn)閴A導(dǎo)致 RNA 水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亞磯、甲醛、甲基氫氧化汞等變 性方法。分子印跡技術(shù)-特點(diǎn)1預(yù)定性，即它可以根據(jù)不同的目的制備不同的MIPS,以滿足各種不同的需要。2識(shí)別性，即 MIPS 是按照模板分子定做的，可專一地識(shí)別印跡分子。3實(shí)用性，即它可以與天然的生物分子識(shí)別系統(tǒng)如酶與底物、抗原與抗體、受體與激素相比 擬，但由于它是由化學(xué)合成的方法制備的，因此又有天然分子識(shí)別系統(tǒng)所不具備的抗惡劣環(huán)境的能力，從而表現(xiàn)出高度的穩(wěn)定性和長(zhǎng)的使用壽命（3）DN

12、A 測(cè)序（雙脫氧法原理）原理利用了 DNA 聚合酶所具有的兩種催化反應(yīng)特性：第一，DNA 聚合酶能以單鏈 DNA為模板，準(zhǔn)確合成出 DNA 的互補(bǔ)鏈；第二，DNA 聚合酶能以 2 ,3-雙脫氧核苷三磷酸 為底物，使之參入到寡核苷酸鏈的 3 -末端，從而終止 DNA 鏈的延長(zhǎng)。在測(cè)序用的緩沖液中 含有四種 dNTP 及聚合酶.測(cè)序時(shí)分成四個(gè)反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的 A, C, G, T 核苷三磷酸（稱為 ddATR ddCTR ddGTP, ddTTP）,然后進(jìn)行聚合反應(yīng).在第一個(gè)反應(yīng) 物中，ddATP 會(huì)隨機(jī)地代替 dATP 參加反應(yīng)一旦 ddATP 加入了新合成的

13、DNA 鏈,由于其 3 位的羥 基變成了氫，所以不能繼續(xù)延伸.所以第一個(gè)反應(yīng)中所產(chǎn)生的DNA 鏈都是到 A 就終止了；同理第二個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的都是以C 結(jié)尾的；第三個(gè)反應(yīng)的都以 G 結(jié)尾，第四個(gè)反應(yīng)的都以 T 結(jié)尾，電泳后就可以讀出序列了 3基因表達(dá)的特點(diǎn)（時(shí)空特異性）基因表達(dá)（gene expression）是指基因的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯等極其復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，最終產(chǎn)生具有生物功能的蛋白質(zhì)的過程，即DNATRNAT蛋白質(zhì)?；虮磉_(dá)是受調(diào)控的時(shí)間特異性按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定的時(shí)間順序發(fā)生，稱之為基因表達(dá)的時(shí)間特異性（temporal specificity）。多細(xì)胞生物基因表

14、達(dá)的時(shí)間特異性又稱階段特異性（stage specificity）。空間特異性基因表達(dá)伴隨時(shí)間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實(shí)際上是由細(xì)胞在器官的分布決定的，所以空間特異性又稱細(xì)胞或組織特異性（cell or tissue specificity）o在個(gè)體生長(zhǎng)全過程， 某種基因產(chǎn)物在個(gè)體按不同組織空間順序出現(xiàn)，稱之為基因表達(dá)的空間特異性（spatial specificity） 4分子克隆：（1）典型的基因重組（切，接，轉(zhuǎn)，增，檢） 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的 DNA）與載體 DNA 接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA 分子一一復(fù)制子

15、，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一 DNA 分子，也稱 基因克隆 或重組 DNA 。DNA 的體外重組（切、接）重組 DNA 分子的轉(zhuǎn)化和篩選（轉(zhuǎn)、增）轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）載體和目的基因的 分離；載體和目的基因的 切割；載體和目的基因的 重組；重組 DNA 的轉(zhuǎn)化 和擴(kuò)增；重組 DNA 的篩選和鑒定。分是指分離制備合格的待操作的DNA,包括作為運(yùn)載體的 DNA 和欲重組的目的 DNA（ 直接分離目的基因； 通過化學(xué)合成法和 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增法(又稱酶促合成法) 獲得基因；通過構(gòu)建 CDNA 文庫(kù)或基因組文庫(kù)，從中篩選目的基因

16、)；”切是指用序列特異的限制性核酸內(nèi)切酶切割載體和目的基因；”接是指用 DNA 連接酶將目的 DNA 同載體 DNA連接起來，形成重組的 DNA 分子；”轉(zhuǎn)是指通過特殊的方法(原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法、 電穿孔轉(zhuǎn)化法)將重組的 DNA 分子送入宿主細(xì)胞中，使原來細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相 應(yīng)變化的現(xiàn)象， “增”進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增；”檢則是從宿主群體中通過方法( 抗生素抗性篩選、3-半乳糖苷酶插入失活型篩選、營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選、原位雜交法篩選、Southern 印跡法篩選、限制性酶切法篩選、蛋白質(zhì)生物學(xué)功能法篩選、免疫沉淀法篩選、聚丙烯酰胺凝膠電泳法篩 選)挑選出攜帶有重組 DNA 分子的個(gè)體。DNA

17、 分子體外連接技術(shù)黏性末端 DNA 片段的連接DNA 連接酶能夠催化外源 DNA 和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA 分子。應(yīng)用DNA 連接酶可在體外將具有黏性末端的DNA 限制片段，插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，從而可能按照人們的意圖構(gòu)建出新的 DNA 雜種分子 平頭末端 DNA 片段的連接T4DNA 連接酶法：可以催化粘端或平端雙鏈DNA 或 RNA 的 5 -P 末端和 3 -OH 末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需ATP 作為輔助因子。同聚物加尾法：應(yīng)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账峒拥?DNA 分子單鏈延伸末端的 3 -0H 基團(tuán)上，它并不需要模板鏈的存在，它一個(gè)一個(gè)加上

18、核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴。 需用 5特異的核酸外切酶處理平末端的DNA 分子上產(chǎn)生帶 5 -0H 的單鏈延伸。化學(xué)合成的銜接物連接 DNA 分子：銜接物(1inker)，是指用化學(xué)方法合成的一段由10-12 個(gè)核苷酸組成的，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。(3) 藍(lán)白斑篩選原理3-半乳糖苷酶插入失活型篩選載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和篩選，當(dāng)有外源基因插入該顯色基因后，其顯色反應(yīng)消失?！舅{(lán)白篩選原理：某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段， 在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制 酶位點(diǎn)的DNA 序列。這些位點(diǎn)

19、上如果沒有克隆外源性DNA 片段，在質(zhì)粒被導(dǎo)入 lac-的大腸桿菌后，質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_(dá)，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal 和誘導(dǎo)劑 IPTGH，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源 DNA 片段，將使 lac Z 基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結(jié)果菌落出現(xiàn)白色。由 于這種顏色標(biāo)志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然。】(4) 工具酶是什么常用的工具酶有哪些工具酶(tool enzymes):指能用于 DNA 和 RNA 分子的切割、連接、聚合、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的 各種酶系統(tǒng)。工具酶的種類：限制性核酸內(nèi)切酶 (restrictio

20、n en do nadease)【I、川型它們識(shí)別與切割順序不在一個(gè)地 方，不產(chǎn)生特異性的 DNA 片段，與基因工程意義不大。n型也就是基因工程說到的限制酶核 酸內(nèi)切酶，n型酶分子量小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔因子，識(shí)別與切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生特異的 DNA 片段。同裂酶:指來源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣 的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。同尾酶:指來源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶】、DNA 連接酶(DNA ligase)【催化有互補(bǔ)順序的兩個(gè) dsDNA 分子的粘性末端或平頭末端 3 -0H、 5 -P 連接作用。 】

21、 、 逆轉(zhuǎn)錄 酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它的酶活性有： 逆轉(zhuǎn)錄酶：以 mRNA 為模板合成 cDNA;DNA 依賴 DNApol:以 ssDNA 為模板， 3-OH DNA 片段為引物， 合成 DNA 鏈。 RnaseH : 外切 RNA 酶活性，底物是 RNA- DNA 雜交分子 RNA 鏈，有兩種：5宀 3外切 RNA,稱 5 T3 外切RNA 酶； 3宀 5 外切 RNA, 稱 3宀 5外切 RNA 酶，也稱 RnaseH。卜DNA 聚合酶（DNApolymerase）5 T3 聚合活性； 3 T5 外切酶活性； 在無 dNTP 時(shí)，可以從任何 3 -OH端外切； 在只有一種 dNTP 時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷暴露時(shí)為止； 在有 4 種 dNTP 均存在時(shí)，聚合酶活性占主導(dǎo)地位。卜 核酸酶（nuclease） 降解 ssDNA或 ssRNA 形成 5 p 末端的單或寡核苷酸，對(duì) DNA 活性強(qiáng)于RNA; 中量 S1 可從切口或小缺口 處降解 dsDNA極大量的 S1 才能降解 dsDNA 或 DNA-RNA 雜交鏈，原因是后者對(duì) S1 降解有抗 性，所以 S1 又稱單鏈特異的核酸酶。卜末端轉(zhuǎn)移酶 催化一個(gè)單核酸（dNTP）加到另一個(gè) DNA 分子的 3 - OH 末端；