常用核酸染料

1、題目：常用核酸染料商品編號商品名稱激發(fā)/發(fā)射峰應(yīng)用規(guī)格D1306DAPI358/461blueSemi-permeant （半透性）AT-selective （AT-堿基專一性）Mycoplasma(支原體)Chromosome and nuclei counterstain Chromosome banding(復(fù)染劑)10mgD3571（dilactate,乳酸基團，水溶性更好）D21490（高純度）H1398Hoechst 33258（二聯(lián)苯胺）；33342（三鹽酸亞精胺）；334580（五水）；激發(fā)峰不同。352/461 bluePermeant (全透性)AT-selectiveMi

2、nor groove-bindingdsDNA-selective binding（雙鏈DNA特異結(jié)合）Cell-cycle studies（細胞周期）Chromosome and nuclear counterstain（復(fù)染劑）100mgH3569（液體）10mlH21491（高純度）100mgP1304MPP3566P21493PI530/625Impermeant(非透性)Dead-cell stain（死細胞染料）Chromosome and nuclear counterstain（復(fù)染劑）100mg10ml100mgA1324ACMA419/483 blueUV？AT-selec

3、tive （AT-堿基專一性）Alternative to quinacrine for chromosome Q banding(Q顯帶) Membrane phenomena(膜現(xiàn)象, 陰陽離子跨膜運動)100mgS7563SYBR Green I nucleic acid gel stain* 10,000X concentrate in DMSO*494/521雙鏈DNA和寡核苷酸超敏感電泳凝膠染料；定量PCR500ulS75671mlS758550ul，共20瓶S7564SYBR® Green II RNA gel stain *10,000X concentrate in

4、 DMSO*492/513RNA和單鏈DNA染料500ulS75681mlS758650ul，共20個S7580SYBR® Green nucleic acid stain starter kit試劑盒包括50 µL of SYBR Green I 染料, 50 µL SYBR Green II RNA gel stain 染料和a SYBR Green/Gold gel stain photographic filter個S34854SYTO® 9-63 fluorescent nucleic acid stain - 5 mM solution in

5、 DMSO419/445-654/675細胞內(nèi)核酸染料，顏色全，藍色、綠色、橙色和紅色；與核酸結(jié)合弱，一般不用于復(fù)染劑，能看到染料的在胞質(zhì)內(nèi)擴散250ulD1306Y3601N21485P3566DAPI：藍色YOYO-1：綠色Hoechst s769121:黃色PI: 橙色紅色藍色、綠色、黃色和橙紅色，核和染色體復(fù)染劑F1200Fura-2, pentapotassium salt細胞內(nèi)Ca離子指示劑，需微注射1 mgF1221Fura-2, AM乙酰羥甲基酯形式，不帶電荷的親脂性化合物，易于滲透脂膜進入活細胞，釋放Fura-2，與Ca結(jié)合釋放熒光1 mgF1241fluo-3 AM488n

6、m特點：能用488nm可見光激發(fā)，對生理過程干涉小。適用廣10 x 50 µgF14201Fluo-4 AM488nm專利產(chǎn)品，信號更強10 x 50 µg1.核酸染色細胞凋亡檢測試劑盒Cat# Viable cell stainApoptotic cell stainDead cell stainExcitation Application V13240None AF488-Annexin VSYTOX® Green（非透性，深綠色）488nm都是綠色，還有其他通道可選，活細胞無色；用于Turkat cells;流式細胞儀V13241NoneAF488-Anne

7、xin VPI(red)488nm標記Annexin V，凋亡細胞綠色，死細胞是紅色，活細胞無色；流式細胞儀，熒光顯微鏡V13242NoneFITC- Annexin VPI(red)488nm標記Annexin V，凋亡細胞綠色，死細胞是紅色，活細胞無色；流式細胞儀，熒光顯微鏡V13243NoneYO-PRO®-1(選擇性透過，綠色)YO-PRO®-1PI(red)488nm標記Annexin V，凋亡細胞中等綠色，死細胞核酸染色是紅色，活細胞無色；流式細胞儀，熒光顯微鏡V13244Hoechst 33342 DimHoechst 33342(Blue)-Bright（更

8、亮）PI(red)UV&488nm凋亡細胞更藍;死細胞核酸染色是紅色和藍色，活細胞藍色；流式細胞儀，熒光顯微鏡V23200NoneBiotin-X annexin V and AF350 streptavidinPI(red)345nm&535nm標記Annexin V，活細胞藍色，死細胞核酸染色是紅色；流式細胞儀，熒光顯微鏡V23201Hoechst 33342 DimYO-PRO®-1Hoechst 33342YO-PRO®-1PI(red)UV&488nm標記核酸，活細胞藍標記核酸，凋亡細胞綠色死細胞核酸染色是紅；流式細胞儀，熒光顯微鏡V351

9、12NoneR-Phycoerythtin- Annexin V(Orange)SYTOX® Green488nm標記Annexin V，凋亡細胞橙色，死細胞核酸染色是紅；流式細胞儀，熒光顯微鏡V35113NoneAllophycocyanin- Annexin V(Far Red)SYTOX® Green488nm&633nm標記Annexin V，凋亡細胞紫紅色，死細胞核酸染色是紅；流式細胞儀，熒光顯微鏡V35114C12-resauzurin(red)Allophycocyanin- Annexin V(Far Red)SYTOX® Green488

10、nm&633nm凋亡初期：凋亡細胞紫紅、活細胞中橙、無綠色死細胞，晚期：紫紅、淺橙、綠色，活細胞：深橙色V35116MitoTracker® RedAF488-Annexin VNone488nm凋亡初期：活細胞紅色、很少綠色，凋亡期：活細胞紅色、凋亡細胞綠色V35121DyeCycle VioletDyeCycle Violet7-AAD（只染死細胞、紅色）405nm&488or532活細胞很少紫色、凋亡細胞深紫色、死細胞紫色和紅色V35123NonePO-PRO-17-AAD405nm&488or532活細胞很少紫色、凋亡細胞深紫色、死細胞紫色和紅色V35

11、124NonePacific Blue Annexin7-AAD405nm&488or532活細胞很少紫色、凋亡細胞深紫色、死細胞紫色和紅色2.TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒Po-Brdu TUNEL Assay Kit凋亡過程，DNA鏈斷裂，TDT識別片段添加Brdu (dUTP), AF488-anti Brdu 抗體結(jié)合上去。另外試劑盒包括PIKit#Cat# substratedyeExcitation Application Kit#1A23210Brdu抗體AF488330nm凋亡細胞綠色，死細胞紅色3.蛋白酶細胞凋亡檢測試劑盒Caspase-3在細胞凋亡過程中起信號放大作用

12、Kit#Cat# substratedyeExcitation Application Kit#1E13183Z-DEVDAMC330nm凋亡細胞藍色Kit#2E13184Z-DEVDR110496nm凋亡細胞綠色引用回復(fù)    特別的“染料”給特別的你：Invitrogen獨家的SYBR GreenER【字體：大 中 小】時間：2006年05月23日 來源：生物通-摘要：    要解決SYBR Green的非特異問題，當然不是只有一條途徑。所謂條條道路通羅馬，不同于Qiagen或者ABI利用的是提高DNA聚合酶的特異性，“曲線救國”

13、，Invitrogen公司采用直接改造SYBR Green的方法，發(fā)展出更特異更靈敏的熒光染料SYBR® GreenER qPCR Reagent System。SYBR Green系列熒光染料由于低毒、靈敏度度優(yōu)于EB而日漸受到科研用戶的歡迎，這個原屬于Molecular Probes公司的專利隨著Probes被并購進入Invitrogen的大家庭，Invitrogen要優(yōu)化它自然更方便啦。    SYBR® GreenER被Invitrogen稱為新一代定量PCR熒光檢測方法的核心技術(shù)之一，相比原有的SYBR Green，最大的優(yōu)勢的發(fā)光強

14、度更強更明亮，使得原來檢測不到的低豐度DNA的信號更容易被檢測到這也就意味著熒光染料的檢測靈敏度提高了，從原來的0.1ng左右提高到6pg，應(yīng)用在定量PCR檢測中就使得基因表達數(shù)據(jù)分析更為可靠。此外，對熒光染料構(gòu)造的修飾使得減少了染料分子對PCR反應(yīng)的抑制作用。SYBR GreenER和原有的SYBR Green一樣適用相同的濾光片，并不需要增加新的儀器或者新濾光片(filters)。SYBR GreenER可以看作是SYBR Green的兼容升級版了，具體的升級優(yōu)化如下： RealTime ready 智力大沖浪！答對5題，即獲贈美國傲仕優(yōu)質(zhì)保溫杯！升級step one：快速反應(yīng)與高靈敏度增

15、加結(jié)果可靠性SYBR GreenER這種新穎的DNA結(jié)合染料的一個顯著特點就是在檢測信號上有了大幅度提高，同時也由于SYBR GreenER消除了一些原有SYBR Green對PCR反應(yīng)的影響（熒光染料結(jié)合入DNA小溝，阻礙擴增反應(yīng)），因此反應(yīng)時間得到了提升。而對于定量PCR反應(yīng)來說，時間越長代表著反應(yīng)越有可能進入平臺期，影響數(shù)據(jù)分析，因此快速的反應(yīng)也可以在一定程度上增加反應(yīng)的可靠性（見下圖）。（通過對目標DNA的定量PCR擴增，可以從圖中看出SYBR GreenER（綠色）比ABI SYBR® Green Master Mix (紅色)，以及 ABI Power SYBR®

16、; Green Master Mix (藍色)早3到4個循環(huán)得到數(shù)據(jù)）同時也正是由于SYBR GreenER在檢測信號方面的改進，因此靈敏度在原有的基礎(chǔ)上又進了一步，可以百分之百檢測到3pg gDNA（約一個人的基因組當量），而這在同類產(chǎn)品中可是是并不常見的（見下）。靈敏度的提高對于檢測單拷貝基因是十分之重要的，尤其是對于稀有復(fù)制子，如果檢測不到很有可能在疾病診斷和治療方面出現(xiàn)紕漏，影響甚大。（這里我們特別就這個問題咨詢了來自Q廠家的專家Ivy，因為上表中Quantitect正是Q家花旦，Ivy表示，Quantitech可以檢測低至5個拷貝的模版，用10pg模版也能得到非常漂亮的曲線（

17、3;“酶”頭一蹙，計上心來 Qiagen vs.ABI(II)參考文中圖片）（這里順便插一句，我們常常看到廠家的宣傳資料中有和其他品牌的對比實驗，這些做實驗的專家們一般只擅長做自家的產(chǎn)品，人家的產(chǎn)品做的結(jié)果都特不好，所以讀者還是要自己多看多思考哦?。┒襋廠家認為光有靈敏度是不夠的，定量的特異性更是非常重要的，Q的特異性是通過引物設(shè)計和試劑盒中的酶和緩沖體系共同來實現(xiàn)的。試劑盒的特異性體現(xiàn)在：使用同樣的引物時，Q的體系反應(yīng)僅得到特異性產(chǎn)物，但是其他同類產(chǎn)品的體系會出現(xiàn)引物二聚體(NTC曲線上升)，Ct值偏高。）升級Step two：重復(fù)特異性可靠的定量PCR數(shù)據(jù)來自于高度的特異性和可重復(fù)性，這

18、也正是傳統(tǒng)SYBR Green的缺陷所在，要改善這一點，SYBR GreenER除了采用了新型的這種GreeER染料，而且在混合液里的DNA擴增酶也進行了化學(xué)修飾，保證其在常溫下不會擴增以及可以長時間4°C保存，這種熱啟動酶活性減少了非特異性擴增。另外SYBR GreenER也同樣采用了UNG，減少污染。這樣得到的混合體系即使是模板量從6pg到1ng都可以保證陰性對照（NTC，no template control，即將目的DNA以水取代作為模板）的熒光信號都保持在40持平水平（見下），說明了這一混合液的高特異性和高重復(fù)性。升級Step three：適合不同系統(tǒng)的多種選擇SYBR G

19、reenER目前可以提供三種不同的體系以供選擇，包括· SYBR® GreenER kits for ABI PRISM® （包括 premixed ROX reference dye，獲得對照） · SYBR® GreenER kits for iCycler® （包括premixed fluorescein，獲得動力學(xué)因子（dynamic well factors），可以用于參照） · SYBR® GreenER Universal（生物通專稿）細胞熒光化學(xué) 一、實驗?zāi)康?、進步熟悉熒光顯微鏡的使用方法。2、初

20、步了解幾種常用的熒光染色方法。二、實驗用品熒光顯微鏡、水浴鍋、載玻片、蓋玻片、鑷子、消毒牙簽三、實驗原理熒光法較一般光學(xué)方法具有靈敏度高、特異性強、方法簡便等優(yōu)點，因此近年來熒光組織化學(xué)特別是免疫熒光技術(shù)有了很大的發(fā)展。利用熒光技術(shù)可研究細胞內(nèi)化學(xué)成分的分布與定位，研究細胞與組織中物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運，進行病理鑒別以及細胞免疫等方面的研究。 當用一種波長的光(如紫外光)照射某種物質(zhì)時，這種物質(zhì)會在極短的時問內(nèi)發(fā)射出較照射波長為長的光(可見的光)，這種光就稱為熒光。有些生物材料受到紫外線照射后能直接發(fā)出熒光稱自發(fā)熒光(或直接熒光)；有的生物材料受紫外線照射后并不發(fā)光，但當它吸收熒光染料后，也同樣產(chǎn)生

21、熒光，稱間接熒光(或次生熒光)。與生物學(xué)有關(guān)的熒光現(xiàn)象有五種： 1、 自發(fā)熒光 如葉綠索、維生素A的紅色熒光、膠原纖維的藍綠色熒光、脂褐素的藍色熒光等。2、 誘發(fā)熒光 通過誘導(dǎo)劑作用而發(fā)的熒光，如甲醛蒸氣處理可誘發(fā)細胞和組織中生物單胺類(兒茶酚胺、5羥色胺等)產(chǎn)生熒光。3、熒光染料染色熒光 即經(jīng)染色后熒光染料與細胞中某些成分結(jié)合而產(chǎn)生的熒光。4、酶誘發(fā)熒光 通過細胞內(nèi)酶的作用，使某些不發(fā)熒光的物質(zhì)轉(zhuǎn)換為發(fā)熒光的產(chǎn)物。如細胞內(nèi)的脂酶可使不發(fā)熒光的二醋酸熒光素分解為發(fā)熒光的熒光素。 5、免疫熒光 熒光染料和抗體以共價鍵結(jié)合，這種標記的抗體再和相應(yīng)的抗原形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)激發(fā)后發(fā)射熒光，用以辨認

22、抗原。細胞和組織所產(chǎn)生的熒光必須通過熒光顯微鏡進行觀察或通過顯微熒光光度計進行定量測定。除少數(shù)生活物質(zhì)含有自發(fā)熒光外，大多數(shù)研究需外加熒光染料，進行特異性結(jié)合而得以顯示。.四實驗方法(一)幾種熒光染料對細胞染色的觀察 細胞吖啶橙熒光染色的觀察 ：吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可對細胞中的DNA和RNA同時染色而顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙紅色熒光。1將生長有培養(yǎng)細胞的玻片或雞血涂片放入95%乙醇中固定1530分鐘，干燥；2在1%醋酸中酸化30秒；3在標本片上滴加足量的001%吖啶橙磷酸緩沖染液，染色5-10分鐘；4用pH48磷酸緩沖液洗1分鐘；50.1molL氯化鈣分化

23、30秒或幾分鐘；6PBS漂洗三次，每次數(shù)秒鐘；7在干凈載玻片上滴滴PBS，將標本片有細胞面向下臨時封固，或在血涂片上滴加磷酸緩沖液后加蓋玻片臨時封固；8在熒光顯微鏡下觀察，用藍紫光激發(fā)濾片，可見細胞核為綠色，細胞質(zhì)為橙紅色，但常因細胞質(zhì)的pH值的變化而呈棕色至鮮紅色。(二)活細胞雙熒光染色觀察細胞核和線粒體 一般的生物染料不能穿透細胞膜，只有當細胞被固定后改變了細胞膜的通透性，染料才能進入細胞內(nèi)。但有些活體染料能進入活細胞，并對細胞不產(chǎn)生毒性作用。熒光染料Ho33342和若丹明123都是活體染料。Ho33342能與細胞中DNA進行特異的結(jié)合，若丹明123能與線粒體進行特異的結(jié)合。采用兩種熒光染

24、料的混合染液可對一個活細胞的核和線粒體同時染色。1. 用牙簽在自己口腔頰粘膜處刮取上皮細胞涂于干凈載玻片上；2.滴一滴雙熒光染液(含025ugmL Ho33342和若丹明123 1ugmL的PBS液)于細胞上；3.加上蓋玻片(注意防止氣泡)，用指甲油把蓋玻片邊緣封好；4.用落射式熒光顯微經(jīng)觀察。先用高倍鏡觀察細胞核(采用紫外光激發(fā)濾片雙色束分離器內(nèi)裝阻斷濾片的組合插塊置于光路)，可見核發(fā)藍熒光。再換油鏡觀察線粒體(換用紫光或藍光的組合插塊)，在細胞核附近的胞質(zhì)中可見有一些發(fā)綠光的圓形和短稈狀顆粒分布，即為線粒體。五、熒光組化實驗中應(yīng)注意的幾個問題1每種熒光染料，均有自己的最適PH值，此時熒光最

25、強。當pH改變時，不僅熒光強度減弱，而且波長將有所改變，因此熒光檢測時要在一定的PH值的緩沖液中進行。2一放熒光染色在20。C以下時熒光比較穩(wěn)定，溫度升高常出現(xiàn)溫度猝滅。3在熒光觀察中，常因激發(fā)光的增強而使樣品熒光很快衰竭，造成觀察和照相困難。為此最好用能量小的長波長光進行觀察，需照相時再適當增強激發(fā)光。4一般熒光染液的濃度在萬分之一以下，甚至億萬分之一，也能使標本著色。在一定的限度內(nèi)，熒光強度可隨熒光素的濃度增加而增強，但超過限度，熒光強度反而下降，這是由于熒光分子間的締合而使自身熒光猝滅所致。我發(fā)現(xiàn)用Goldview染色后,隨著電泳時間的延長,紫外照射下的熒光強度越來越弱,如下圖:不知道大

26、家用的時候有沒有類似的情況出現(xiàn)?有什么好的方法避免嗎? 呵呵,你是直接把Goldview加入到膠中進行電泳吧.在電泳時,一般我們都知道核酸由負級向正級泳動.但如果制膠時就加入EB或Goldview的話,這些熒光染料也有自己的泳動方向-正級向負級!正好和核酸電泳遷移方向相反。你的電壓(160),呵呵,有些偏大(不曉得你的電泳槽和膠的長度,但感覺還是蠻大,我們一般常的小于120).,10min后,Goldview泳動到紅色上邊框處(下圖),15min后泳動到蘭色上邊框處,20min后泳動到綠色上邊框處,而紅、蘭、綠方框內(nèi)是沒有熒光染料或僅有微弱的殘留。由于沒有了Goldview染色，所以電泳20m

27、in后你觀察不到核酸著色帶。但隱約還是可以看到一點點微弱的著色（黃色豎線處）。不是Goldview染料有問題，想避免這種情總發(fā)生，可以將Goldview加入電泳液（如果電泳槽體積小，電泳液更換不頻繁的話。嘿，為了節(jié)約嘛）；也可以制膠時不加入Goldview，先電泳，后染色；當然，也可以把電壓調(diào)小些，電泳時間短一點！你再試試看！呵呵，EB也是一樣哦。EB染色有問題的戰(zhàn)友同樣可以參考！ 馬上就要做熒光檢測了，可是在園子里一搜居然這么多方法不太明白ho雙染是不是說可看出凋亡，可測出細胞壞死雙染后壞死細胞被染成紅色，凋亡細胞被染成亮蘭色？和是在板子里加完細胞就加，還是培養(yǎng)小時，細胞貼壁后再加？用孔板嗎

28、？不清楚，請各位高手幫忙！謝謝！Hoechest/PI雙染法檢測細胞凋亡的原理是：早期死亡細胞膜通透性狀態(tài)的不同是區(qū)分細胞凋亡和壞死的一個重要指標，凋亡細胞在進入最終溶解階段前，胞膜通透性無明顯改變，相對分子質(zhì)量大的、能與DNA結(jié)合的熒光染料（如PI）不能進入凋亡細胞內(nèi)，而相對分子質(zhì)量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細胞攝取。利用這一特點，將被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測細胞懸液中的細胞熒光強度可區(qū)分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。正常細胞由于對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈強的紅色熒光。具體操作是待細胞處理結(jié)束后（貼壁不是標準），收集約10100萬個細胞（96孔板單孔應(yīng)該收集不到這么多的細胞），分別用PI和Hoecha染料染色后，進行流式細胞儀分析或熒光顯微鏡觀察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外線激發(fā)，前者熒光為紅色（620nm），后者熒光為藍色（480nm）。我做過熒光顯微鏡觀察細胞凋亡，但是Hoechst33342單染，效果同雙染差不多，具體操作如下，可供參考：將培養(yǎng)于含蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中細胞，給予不同濃度