熱休克蛋白70對(duì)供心一氧化氮及一氧化氮合酶表達(dá)的影響

1、熱休克蛋白70對(duì)供心一氧化氮及一氧化氮合酶表達(dá)的影響【摘要】 目的 探討熱休克蛋白70 (HSP70) 對(duì)供心一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的影響。方法 Wistar 大鼠18只,分為2組：對(duì)照組(C，n = 9)，腹腔注射生理鹽水0.5 ml，24 h后取離體心臟灌注康斯特保護(hù)液（HTK液）,4保存3 h后建立Langendorff離體心臟灌注模型,灌注KH液2 h；實(shí)驗(yàn)組(E,n = 9)腹腔注射重酒石酸去甲腎上腺素(溶于生理鹽水中)3.1mol/kg(0.53mg/kg)，腹腔注射24 h后取離體心臟,處理方法同C組。測(cè)定心肌HSP70含量、NO、NOS的含量以及相關(guān)生化指標(biāo)并

2、做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理比較。 結(jié)果 HSP70含量E組較C組明顯增高(P<0.01) ,NO、NOS的含量E組較C組明顯增多(P<0.01) ,生化指標(biāo)E組明顯優(yōu)于C組。結(jié)論 心肌HSP70高表達(dá)對(duì)供心具有明顯的保護(hù)效應(yīng)，并且其促進(jìn)心肌NO、NOS的表達(dá),可能是HSP70發(fā)揮心肌保護(hù)作用的因素之一。 【關(guān)鍵詞】 熱休克蛋白70；一氧化氮；一氧化氮合酶Abstract: OBJECTIVE To investigate the protection of heat shock protein 70 on donor heart and the effects on expres

3、sion of myocardial cell nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) of isolated rat heart. METHODS 18 Wistar rats were randomly divided into 2 groups. Control group (C,n = 9) ,Normal saline 0.5ml was injected intraperitoneally and 24 hours later isolated hearts were stored in 4 for 3 hours wit

4、h Histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) solutions, and then isolated hearts were perfused for 2 hours by Langendorff model. Experimental group (E,n = 9), Noradrenaline Bitartrate 3.1mol/kg(0.53mg/kg) was injected intraperitoneally and 24 hours later isolated hearts were stored in 4 for 3 hours wi

5、th HTK,and then isolated hearts were perfused for 2 hours with Krebs-Henseleit (K-H) solutions by Langendorff model. Myocardial HSP70 content , the expression of NO，NOS and related biochemical indicators were detected. RESULTS HSP70 ，NO and NOS in E group are higher than those in C group and biochem

6、ical indicators in E group is better than that in C group . CONCLUSION This study demonstrated that the high expression of HSP70 has obvious protection on donor heart ,and it can markedly affect the expression of NO，NOS of isolated rat heart and it is perhaps one of important factors for myocardial

7、protection.Key words： Heat shock protein 70；Nitric oxide；Nitric oxide synthase熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一組所有的細(xì)胞能在應(yīng)激情況下由熱休克基因所編碼合成的序列高度保守的伴隨細(xì)胞蛋白, 并能對(duì)抗更為嚴(yán)重的應(yīng)激損傷, 研究發(fā)現(xiàn)在高溫、缺氧、再灌注、局部損傷或感染等多種有害因素1刺激均可產(chǎn)生熱休克蛋白。HSP70是HSP中最保守、最主要、含量最豐富的一類。實(shí)驗(yàn)表明一氧化氮(NO) 、一氧化氮合酶(NOS) 作為效應(yīng)因子可介導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用, HSP70心肌保護(hù)作用是否與供心

8、缺血再灌注后NO、NOS表達(dá)有關(guān)尚未可知,本實(shí)驗(yàn)的目的是探討HSP70在發(fā)揮供心心肌保護(hù)作用時(shí)與NO、NOS的關(guān)系。1 資料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性Wistar大鼠18只,體重250350 g,由青島市藥檢所動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為2組(n=9):對(duì)照組(C組):腹腔注射生理鹽水0.5 ml,注射后24 h取離體心臟,灌注Histidine-tryptophan-ketoglutarate(HTK)心臟保護(hù)液,儲(chǔ)存于4保存液中3 h,然后心臟行Langendorff灌注Krebs-Henseleit(K-H)液2 h；實(shí)驗(yàn)組(E組),腹腔注射重酒石酸去甲腎上腺素(溶于生理鹽水中)3.1

9、mol/kg(0.53mg/kg)，24 h后取離體心臟,余處理步驟同C組。心臟灌流結(jié)束后取左室心肌組織測(cè)定。HTK液和KH液自行配制2，配制試劑購(gòu)自上?；菖d生化試劑有限公司。1.2 測(cè)定指標(biāo)1.2.1 心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）10min漏出率測(cè)定。復(fù)灌后10min ,留取冠脈流出液,置于-20冰箱中保存,以備測(cè)定心肌酶漏出量。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定CK、LDH濃度。單位: IU/(10min·g)。CK(LDH)漏出率=CK（或LDH）（IU/L）×10min漏出液 1000×心肌濕重(g)1.2.2 心肌含水量（MWC）測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在固定部

10、位取心室肌約100 mg，先用濾紙吸干心肌表面水分，使用電子天平稱心肌濕重。然后將心肌置入100恒溫烤箱烘烤5 h，待恒重后稱干重，計(jì)算MWC。單位：%。MWC= 心肌濕重-心肌干重心肌濕重×100% 。1.2.3 心肌NO、NOS含量測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)束后在同一部位取心肌組織約200 mg，吸干水漬后置入液氮保存。測(cè)定前稱重，剪取100 mg左右心肌組織塊,研磨成10 %勻漿,低溫離心,取上清液,測(cè)定上清液中NO、NOS含量(化學(xué)法，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行測(cè)定)。1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織HSP70含量。試驗(yàn)結(jié)束后在同一部位取左室心肌組織，10

11、%甲醛液固定，制備石蠟切片。免疫組化染色嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行（采用SP法，試劑由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）。HSP70表達(dá)位于心肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì), DAB染色棕色顆粒為陽性產(chǎn)物。光鏡觀察后應(yīng)用MPIAS-1000型多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析, 并自動(dòng)測(cè)量染色陽性面積。每張切片隨機(jī)選10個(gè)視野(×400) , 以染色陽性面積占視野面積的百分比的均值作為HSP70的表達(dá)量。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s )表示,使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系采用直線相關(guān)分析。2 結(jié)果2.1 心肌HSP70、NO、NOS的含量 HSP7

12、0表達(dá)量E組明顯高于C組(t=17.96，P<0.01)，見圖1、圖2；心肌NO、NOS的含量E組明顯高于C組 (t=4.96，P<0.01；t=7.19，P<0.01) ,見表1。表1 心肌HSP70表達(dá)、NO、NOS的含量（略）注：*與C組比較，P<0.01圖1 E組HSP70表達(dá)（×400） （略）圖2 C組HSP70表達(dá)（×400）（略）2.2 心肌生化指標(biāo) LDH和CK 10 min漏出率、MWC含量E組較C組明顯降低(t=15.81，P<0.01；t=9.82,P<0.01；t=

13、4.13,P<0.01),見表2。表2 心肌組織的CK和LDH10min漏出率、MWC（略）注：與C組比較，P<0.013 討論 熱休克蛋白又稱應(yīng)激蛋白，參與細(xì)胞的損傷與修復(fù)。HSP70 是一族最保守和最重要的熱休克蛋白家族。HSP70 在應(yīng)激后生成最為顯著, 它作為分子伴侶參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、裝配,維持某些肽鏈的伸展?fàn)顟B(tài),以利其跨膜轉(zhuǎn)位，在線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等不同的區(qū)域內(nèi)發(fā)揮作用，在細(xì)胞的信息傳遞、生長(zhǎng)、分化中具有重要的調(diào)控作用,同時(shí)它又可以促進(jìn)某些變性蛋白質(zhì)的降解清除，重新激活某些酶的活性，維持細(xì)胞的正常生理功能，作為一種內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)對(duì)臟器損傷產(chǎn)生自身保護(hù)作用

14、3。目前國(guó)內(nèi)外已有許多實(shí)驗(yàn)證明了HSP70在心肌缺血再灌中發(fā)揮了保護(hù)作用。NO、NOS 在心肌缺血再灌注中的作用引起人們的注意并進(jìn)行了廣泛的研究, 大量證據(jù)表明NO系統(tǒng)在缺血再灌注過程中扮演著重要角色, 但研究結(jié)果分歧較大。有人認(rèn)為NO、NOS 可能是減輕心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)性因素之一4-6，對(duì)HSP70發(fā)揮供心保護(hù)作用是否與NO、NOS有關(guān)，關(guān)系如何也少有報(bào)道。 心臟移植是終末期心臟病確定的治療手段 ,供心保護(hù)效果在很大程度上決定了移植的成功與否,并對(duì)移植后的遠(yuǎn)期療效也起到重要作用。心臟移植過程要經(jīng)歷常溫缺血、低溫保存、以及缺血后的再灌注。目前理論研究和臨床實(shí)踐都證實(shí)了心肌缺血再灌注損傷

15、的存在7-8,低溫保存的目的是降低組織代謝, 減少缺氧組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求, 但是也同時(shí)破壞了正常的生理狀態(tài), 一定程度上加重心肌結(jié)構(gòu)和功能的損害9。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M心臟移植過程，將離體供心經(jīng)過3個(gè)小時(shí)的低溫保存（兩組均采用目前成功應(yīng)用于臨床并具有卓越心肌保護(hù)作用的HTK液作為心肌保護(hù)液）后進(jìn)行再灌注，結(jié)果表明，與C組比較, E組在再灌注期間,LDH、CK的漏出率及MWC含量減少, E組NO、NOS的含量明顯高于C組，說明NO、NOS在心臟移植過程中對(duì)供心心肌缺血再灌注及低溫保存期間的損傷具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)證明心肌NO、NOS的含量與HSP70的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(r =0.887，0.953) ，證

16、實(shí)了HSP70可促進(jìn)供心心肌細(xì)胞NO、NOS的表達(dá)，這也提示我們HSP70促進(jìn)NO、NOS的表達(dá)可能是其發(fā)揮供心心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一。【參考文獻(xiàn)】 1 Morimoto R, Sarge KD, A bravya K. Transcriptional regulation of heat shock genes:a paradigm for inducible genomic responseJ. J Bio l Chem,1992,267(31):21987-21990.2 張濤，高長(zhǎng)青，李佳春，等.康斯特保護(hù)液對(duì)中低溫離體大鼠心肌的保護(hù)作用J.中國(guó)體外循環(huán)雜志，2006，4（1）：33-

17、35.3 Gusarova V,Caplan AJ,Brodsky JL,et al.Apoprotein B degradation is promoted by the molecular chaperones HSP90 and HSP70J.J Biol Chem,2001,276(27):24891-24892.4 Sumeray MS ,Rees DD , Yellon DM. Infarct size and nitric oxide synthase in murine myocardiumJ. J Mol Cell Cardiol . 2000 ,32(1) :35-42.5 Hannan RL , John MC, Kouretas PC,et al. Deletion of endothelial nitric oxide synthase exacerbates myocardial stunning in an isolated mouse heart model J. J Surg Res,2000,93(1) :127-132.6 Zingarelli B, Hake PW,Yang Z,et al. Absense of inducible nitric oxide synthase modulates early reperfusion