免疫學(xué)實驗講義

1、實驗一 凝集反應(yīng)實驗?zāi)康模?1. 掌握凝集反應(yīng)的原理 2. 直接凝集反應(yīng) 3間接凝集反應(yīng)實驗內(nèi)容： 1. 直接凝集反應(yīng) 2間接凝集反應(yīng)實驗原理：當(dāng)顆粒性抗原與其相應(yīng)的抗體特異結(jié)合時，在電解質(zhì)存在下，兩者比例合適時，可出現(xiàn)凝集顆粒，此現(xiàn)象稱凝集反應(yīng)。一、直接凝集反應(yīng)一血型鑒定 人類血型是以紅細(xì)胞表面所帶抗原的不同而命名。紅細(xì)胞表面主要帶A、B兩種抗原，人類血清中主要含有兩種抗體（抗A或抗B抗體），用抗 A或抗B標(biāo)準(zhǔn)血清可以鑒定四種不同的血型，既A、B、AB、O表型?，F(xiàn)介紹玻片直接凝集法。 （一）材料：人抗A和抗B標(biāo)準(zhǔn)血清、被檢者紅細(xì)胞、采血針、試管、載玻片、滴管、皮膚消毒劑。 （二）方法1、 取

2、清潔載玻片，用記號筆劃分兩半，左角上注 A字，右角上注B字2、 用酒精棉球消毒指端皮膚，針刺受檢者指端，取血分別滴在載玻片左右兩端3、  于玻片 A側(cè)中央加抗 A型標(biāo)準(zhǔn)血清一滴，于玻片B側(cè)中央加抗B血清一滴，充分混勻。4、  510min后肉眼或低倍鏡觀察結(jié)果，以凝集現(xiàn)象的有無，按下表報告結(jié)果。 血型 凝集現(xiàn)象 抗 B標(biāo)準(zhǔn)血清 抗 A標(biāo)準(zhǔn)血清 O A B AB   二、間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原吸附在惰性顆粒載體上，與其相應(yīng)抗體可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)。本實驗用豬乙型腦炎乳膠凝集實驗抗體檢測試劑盒進行驗證試驗。 （一）材料：陰性對照血清、陽性對照血清、乳膠抗原、

3、載玻片等。 （二）方法1、取潔凈載玻片，用記號筆分為兩格。2、分別取陰性對照血清和陽性對照血清于載玻片兩端。4、然后各加一滴乳膠抗原，分別混勻。5、緩慢搖動25min，并觀察結(jié)果。思考討論 1、直接凝集反應(yīng)與間接凝集反應(yīng)的區(qū)別。實驗二 免疫沉淀反應(yīng)實驗?zāi)康模?1. 掌握免疫沉淀反應(yīng)的原理 2. 瓊脂糖雙向免疫擴散實驗內(nèi)容： 1. 瓊脂糖雙向免疫擴散實驗原理： 當(dāng)可溶性抗原與其相應(yīng)抗體相遇，在有電解質(zhì)存在的條件下，二者比例合適可出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀，故名沉淀反應(yīng)。 一、瓊脂糖雙向免疫擴散 在含有電解質(zhì)的瓊脂中，抗原抗體分子互相彌漫擴散，當(dāng)比例合適時可出現(xiàn)沉淀帶。此法可用于分析抗原成分，以及鑒定

4、抗體的純度等。 （一）材料：1生理鹽水瓊脂糖、人IgG、抗人IgG、載玻片、打孔器等。 （二）方法 1、將1鹽水瓊脂糖加熱溶化。2、取一潔凈載玻片，放水平臺上，將已熔化的瓊脂34ml趁熱傾注在玻片上制成厚薄均勻的瓊脂糖凝膠板。3、待瓊脂凝固后，按圖21打孔。 4、在中心孔內(nèi)加入人IgG。5、于周圍各孔中分別加入不同稀釋倍數(shù)的抗人IgG。6、將瓊脂糖凝膠板放濕盒中，置37溫箱中24h后，取出觀察結(jié)果。 圖 2.1實驗三 免疫酶技術(shù)ELISA實驗?zāi)康模?1. 掌握免疫酶技術(shù)ELISA的原理 2. 掌握免疫酶技術(shù)ELISA的技術(shù)實驗內(nèi)容： 免疫酶技術(shù)ELISA之雙抗夾心法實驗原理：免疫酶技術(shù)是利用酶

5、標(biāo)記抗體或抗原，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其原理是酶與抗體或抗原結(jié)合后既不改變抗體或抗原的特異性及免疫反應(yīng)性，也不影響酶的催化效能。當(dāng)存在相應(yīng)酶底物時，酶能催化產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物，顏色的有無及深淺能反映相應(yīng)的抗原或抗體是否存在及其量的多少。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一類常用的免疫酶技術(shù)，可用于測定抗體，也可用于檢測抗原。該實驗常用的酶為辣根過氧化物酶，底物為鄰苯二胺（OPD）。實驗方法有間接法、雙抗體夾心法和抗原競爭法。本實驗采用雙抗夾心法（抗體-抗原-酶標(biāo)抗體） 一) 材料和試劑：羊抗人IgG抗體、不同濃度的人IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG；包被液：pH 9.6

6、 0.05mol/L碳酸鈉緩沖液；稀釋液：1%BSA（PBS稀釋）；洗滌液：pH 7.4 0.01mol/L PBS-吐溫20、底物溶液：OPD-H2O2、終止液：2mol/L H2SO4、96孔酶標(biāo)反應(yīng)板等。 二) 操作步驟 1、包被：將羊抗人IgG抗體用包被液適當(dāng)稀釋，在96孔板的1-5孔中每孔加100微升，置37兩小時后再移置4過夜2、 洗滌：傾去包被液，用洗滌液PBS-吐溫20加滿各孔，振洗3min，傾去，如此反復(fù)3次。3、加樣：將不同濃度的人IgG分別加入1-4孔（1；1:2；1:4；1:8），5號孔做陰性對照，人IgG用PBS-T20代替，6號孔做空白對照（第一步不用羊抗

7、人IgG抗體包被，僅檢測試劑）4、37孵育1h5、 洗滌3次（同上）6、 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG（其稀釋度根據(jù)預(yù)試結(jié)果而定）每孔100ml，（PBS-T20稀釋）7、 37孵育1h。8、  洗滌3次（同上）。8、  顯色：加新鮮配制的底物溶液，每孔100ml，在室溫下避光放置10min。9、 終止反應(yīng)：每孔加2mol/L H2S04 50ml。10、用肉眼觀察每孔顏色深淺。 三）結(jié)果觀察與分析空白對照及陰性對照應(yīng)無色。參考蛋白各孔呈棕黃色，并呈明顯的顏色深淺梯度。四）注意事項1、  在加已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗體時，注意更

8、換槍頭，避免將高濃度的抗體帶入低濃度的孔中引起誤差。2、  應(yīng)盡量避免孔中有氣泡，以免所測得OD值不準(zhǔn)確。  思考討論：1、 ELISA操作中的注意事項。2、 什么是假陽性與假陰性？ELISA的假陽性與假陰性發(fā)生的原因有那些？實驗四 小鼠脾細(xì)胞分離、形態(tài)觀察及計數(shù)實驗?zāi)康模?1. 掌握小鼠脾細(xì)胞分離技術(shù) 2. 觀察小鼠脾細(xì)胞的形態(tài)并計數(shù)實驗內(nèi)容： 1. 小鼠脾細(xì)胞分離 2觀察小鼠脾細(xì)胞的形態(tài)并計數(shù)一）材料和試劑：小鼠、帆布手套、酒精、無菌剪刀、鑷子及注射器活塞、一次性小號無菌培養(yǎng)皿、無菌PBS液、無菌紅細(xì)胞裂解液、帶蓋的無菌離心管、計數(shù)板、顯微鏡、離心機、超凈工作臺(帶紫外

9、燈)、滅菌鍋、移液槍及無菌槍頭等。二) 操作步驟1、小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡3分鐘，取出小鼠置于無菌超凈臺上，肚皮朝上。 2、在小鼠肚皮中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，先找到胃，再找到緊貼胃的紅色長條狀脾臟。 3、取出脾臟，放入盛有PBS液的一次性小號無菌培養(yǎng)皿中。 4、用鑷子將脾臟表面的粘液等洗去，然后用鑷子將脾臟轉(zhuǎn)移到另一盛有少量PBS的一次性小號無菌培養(yǎng)皿中，用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，盡量研碎并反復(fù)用適量PBS清洗。5、棄去PBS，加適量紅細(xì)胞裂解液繼續(xù)研磨。7、棄去紅細(xì)胞裂解液，用PBS重懸細(xì)胞后1000r離心5分鐘。8、用1mlPBS重懸后滴加適量在載玻片上。8、用顯微

10、鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。注： 1.一般6-8周齡小鼠2.手術(shù)器械滅菌：術(shù)前高壓滅菌外，也可將手術(shù)器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精燈上燒灼去除酒精，即可保證無菌，此法較為簡便。思考討論 1、如何保證分離小鼠脾細(xì)胞過程中無微生物污染？實驗五 小鼠的注射方法及血液采集方法實驗?zāi)康模壕毩?xí)對小鼠注射的操作方法與小鼠的采血方法實驗內(nèi)容：小鼠注射的操作方法與小鼠的采血方法一、材料和試劑 1、實驗動物： 小鼠 2、實驗試劑： 滅菌的生理鹽水（代替實驗材料，用以注射）3、儀器或其它用具 無菌注射器（1ml），剪刀，鑷子，碘酒棉花，75%的酒精棉花，消毒干棉花，無菌棉簽，無菌棉球，毛細(xì)吸管，橡皮吸管頭

11、，無菌管，一次性手套若干，帆布手套若干。二、操作步驟一）小鼠注射：常用的注射途徑有皮下、皮內(nèi)、肌肉、腹腔和靜脈等1、取出無菌注射器及針頭，吸入注射材料（本實驗以生理鹽水代替），并排盡空氣（若材料具有傳染性，則排氣時以消毒棉花包住針頭，以免傳染材料外溢而污染環(huán)境）。2、皮下注射：將藥液推入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細(xì)血管、淋巴管吸收進入血液循環(huán)的過程。作皮下注射常選項背或大腿內(nèi)側(cè)的皮膚。操作時，戴上手套，用右手拖鼠尾，使其爬行于較粗糙的臺面或鐵絲試管架的底面，再用左手拇指和食指緊抓小鼠頸部兩耳之間的皮膚，將手翻轉(zhuǎn)，使小鼠腹部向上，左手無名指和小指夾住鼠尾和后肢；先用碘酒棉花，后用75%的酒精棉花消毒小鼠

12、腹部皮膚，右手持備好的注射器，針頭稍平刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動，易擺動則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無回血，可緩慢地注射若干生理鹽水（注射快慢要適度，以免注射液溢出），注射量約為0.10.3ml。拔針時用無菌棉簽輕壓進針部位片刻，以防止藥物外漏。針頭拔出后，皮下呈擴散狀隆起者為注射正確。3、皮內(nèi)注射：將藥液注入皮膚的表皮河真皮之間，觀察皮膚血管的通透性變化或皮內(nèi)反應(yīng)，接種、過敏實驗等一般作皮內(nèi)注射。操作時，戴上手套，1人固定小鼠，另1人先將注射部位的被毛剪掉，局部常規(guī)消毒，左手拇指和食指按住皮膚使之繃緊，在兩指之間，用注射器針頭穿刺，針頭進入皮膚淺層，再向上挑起并梢刺入，將生理鹽水注入

13、皮內(nèi)。注射后皮膚出現(xiàn)一白色小皮丘，而皮膚上的毛孔極為明顯。注射量為0.1ml/次。拔針時用無菌棉簽輕壓進針部位片刻，以防止藥物外漏。4、肌肉注射：小鼠體積小，肌肉少，很少采用。當(dāng)給小鼠注射不溶于水而混懸于油或其他溶劑中的藥物時，采用肌肉注射。操作時，戴上手套，1人固定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的1條后肢，右手拿注射器。將注射器與半腱肌呈90°角迅速插入1/4，注入生理鹽水，用量不超過0.1ml。拔針時用無菌棉簽輕輕按住進針部位片刻，以防止藥物外漏。5、腹腔注射：戴上手套，抓取與固定小鼠同皮下注射。使小鼠的頭部向下，這樣腹腔中的器官就會自然倒向胸部，防止注射器刺入時損傷大腸、小腸等器官

14、。右手持注射器，進針的動作要輕柔，防止刺傷腹部器官。尤其是對于體重較小的小鼠，腹腔注射時針頭可以在腹部皮下穿行一小段距離，最好是從腹部一側(cè)進針，穿過腹中線后在腹部的另一側(cè)進入腹腔，注射0.1ml生理鹽水，注射完后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。拔出針頭后，用無菌棉簽輕壓注射部位。6、靜脈注射：將小鼠放在金屬籠或鼠夾中，通過金屬籠或鼠夾的孔拉出尾巴（也可人工國定小鼠），戴上手套，用左手抓住小鼠尾巴中部。小鼠的尾部有2條動脈和3條靜脈，2條動脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面,3條靜脈呈品字型分布，一般采用左右兩惻的靜脈.拔去沿尾部靜脈走向的毛，置尾巴于4550溫水中浸泡幾分鐘或用75%酒精棉

15、球反復(fù)擦拭尾部，以達到消毒和使尾部血管擴張及軟化表皮角質(zhì)的目的。行尾部靜脈注射時，以左手拇指和食指捏住鼠尾兩惻，使靜脈更為充盈，用中指從下面托起尾巴，以無名指夾住尾巴的末梢,右手持注射器，使針頭與靜脈平行(小于30°角)，從尾巴的下1/3處進針，開始注入藥物時應(yīng)緩慢，仔細(xì)觀察，如果無阻力，無白色皮丘出現(xiàn)，說明已刺入血管，可正式注入生理鹽水（正常情況下，推注的過程應(yīng)該沒有明顯阻力，血管也不會鼓起。推液時動作宜輕柔，若發(fā)現(xiàn)血管鼓起，那是針頭沒有刺入血管，需立即拔出針頭。）。有的實驗需連日反復(fù)尾靜脈注射，注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始（但是進針部位也不可以太靠下，因為越往下，靜脈越細(xì)，操作越難

16、，一般以小鼠尾巴下三分之一的位置比較好），按次序向尾根部移動，更換血管位置注射給藥。注射量為0.050.1ml/10g體重。拔出針頭后，用無菌棉簽輕壓注射部位12min，防止出血。二）小鼠采血：常用的采血方法有剪尾采血、靜脈采血、摘除眼球采血、心臟采血、頜下靜脈叢采血。1、剪尾采血：戴上手套，拇指和食指從背部抓住小鼠頸部皮膚，將小鼠頭朝下，小鼠固定后將其尾巴置于50°熱水中浸泡數(shù)分鐘，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖12mm，用EP管接流出的血液，同時自尾根部向尾尖按摩。取血后用無菌棉球壓迫止血并用6%液體火棉膠涂在傷口處止血。每次采血量0.1ml。此方法無需麻醉、創(chuàng)

17、傷小、可重復(fù)采血，是一種簡便、安全、快速的采血方法。2、靜脈采血：戴上手套，固定小鼠,將采血注射針頭刺入頜下靜脈叢血管取血，每次采血量可達到0.3-0.5 ml。此方法無需麻醉、創(chuàng)傷小、采血量大并可重復(fù)采血，是一種簡便、安全、快速、采血量多的采血方法。3、摘除眼球采血：戴上手套，左手抓住小鼠頸部皮膚，輕壓在實驗臺上，取側(cè)臥位，左手食指盡量將小鼠眼周皮膚往頸后壓，使眼球突出。用眼科彎鑷迅速夾去眼球，將鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完畢立即用無菌紗布壓迫止血。每次采血量0.10.6ml。4、心臟采血：戴上手套，小鼠仰臥位固定，剪去胸前區(qū)被毛，皮膚消毒后，用左手食指在左側(cè)第34肋間觸摸到心搏處，

18、右手持帶有45號針頭的注射器，選擇心搏最強處穿刺，當(dāng)刺中心臟時，血液會自動進入注射器。每次采血量0.50.6ml。5、斷頭采血：戴上手套，右手用剪刀剪斷小鼠頸部約1/24/5，讓血液流入試管。此法可采血0.81.2ml。6、頜下靜脈叢采血：徒手固定法:將小鼠固定在左手中。在小鼠頭部下頜部準(zhǔn)確把握頜下靜脈叢血管位置(位于下頜骨后方咬肌邊緣)。酒精棉球擦拭采血部位消毒后, 將滅菌注射針頭迅速刺入頜下靜脈叢血管，血液即流出。采血結(jié)束, 立即用滅菌干棉球壓迫止血。每次采血量0.5ml, 可重復(fù)采血。注：1.避免小鼠咬人，避免針頭等器械傷人；2.注射前要注意調(diào)整好注射器，在裝好針頭吸取注射液后，一定要排

19、除空氣，特別是注射粘性材料，如油包水乳劑時更為重要，假如有氣泡存在，它將被皮膚對注射的阻力所擠壓，而引起注射釋放量減少，也會使殘余的注射液在拔出針頭時滲漏出來；3.采血的注射器與針頭及盛血的容器最好用干熱滅菌法，因為如果帶有水分會溶解紅細(xì)胞，若用高壓蒸氣滅菌法，在滅菌后一定要烘干。思考討論：1、如何抓小鼠既避免小鼠咬人，由使它不亂動？2、如果注射傳染性材料，應(yīng)注意哪些？3、采血所用的注射器和容器要注意些什么？一項小鼠采血新技術(shù)頜下靜脈叢采血法余琛琳1, 趙 樂2, 湯 球1, 崔淑芳1( 1 第二軍醫(yī)大學(xué)訓(xùn)練部實驗動物中心,上海 200433; 2 和記黃埔醫(yī)藥有限公司,上海) 在動物實驗研究

20、中, 特別是生理學(xué)、 藥理學(xué)、 藥物代謝動力學(xué)等研究中, 經(jīng)常要采集實驗動物的血液樣本進行常規(guī)質(zhì)量檢測、 細(xì)胞學(xué)實驗或進行生理、生化分析1。目前, 小鼠常用的采血方法有眼眶后靜脈叢采血法、眼球摘除采血法、心臟采血法、剪尾采血法等2,不同的采血方法適用于不同的實驗用途和所需血量。本實驗經(jīng)過解剖、觀察小鼠頭部淺層血管,發(fā)現(xiàn)其頜下部靜脈血管豐富、位置淺表,嘗試并建立了小鼠頜下靜脈叢采血的新方法。該方法無需麻醉、創(chuàng)傷小、采血量大并可重復(fù)采血, 是一種安全、快速、簡便、采血量多的采血方法。材料實驗動物: 2月齡昆明小鼠, 雌雄10只, 由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供合格證號: SCXK(滬) 20072

21、0003。實驗器材:滅菌6號注射針頭、酒精棉球、滅菌離心管、滅菌干棉球、抗凝劑等。方法徒手固定法:將小鼠固定在左手中 (圖1)。在小鼠頭部下頜部準(zhǔn)確把握頜下靜脈叢血管位置,如圖2中箭頭所指位置,血管位于下頜骨后方咬肌邊緣。酒精棉球擦拭采血部位消毒后, 將滅菌注射針頭迅速刺入頜下靜脈叢血管 (圖3) , 血液即流出 (圖4)。采血結(jié)束, 立即用滅菌干棉球壓迫止血。 將血液收集于滅菌離心管內(nèi),編號備用(圖1 4 見封三)。結(jié)果通過頜下靜脈叢采血方法的應(yīng)用, 單人操作采血20 次,每只小鼠采血用時約為 3059s, 平均每次 ( 47±8) s 內(nèi)即可完成對一只小鼠單次采血的整個過程。操作

22、熟練的實驗人員,可以在更短時間內(nèi)完成采血過程。使用頜下靜脈叢采血法對雌雄各10只小鼠進行采血操作,每只小鼠采血量范圍為0.3 0.5 mL，每只小鼠平均采血量可達 ( 0.38±0.07) mL。討論已有的眾多采血方法各有其優(yōu)缺點。例如,對于體重為25 g左右的成年小鼠, 眼眶后靜脈叢采血法采血量比較多, 約為0.2 0.3 m L, 并可重復(fù)采血,但易損傷眼球; 眼球摘除采血法采血量多,約為0.3 0.4 mL,但不可重復(fù)采血, 而且可致小鼠失明,易感染,止血不嚴(yán)時還可致小鼠死亡,同時也不符合動物福利基本原則; 心臟采血法采血量可達 0.8 mL, 但由于小鼠個體小、心臟小、心臟搏動快, 采血時位置較難固定3, 因而操作難度系數(shù)大, 需要麻醉, 且容易因操作問題導(dǎo)致動物死亡; 剪尾采血法, 雖可以連續(xù)多次采血, 但每次采血量極少, 不到 0.1 mL, 不適于需要較多血量的實驗 4