動(dòng)物細(xì)胞融合

1、動(dòng)物細(xì)胞融合【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解動(dòng)物細(xì)胞融合的常用方法2. 學(xué)習(xí)化學(xué)融合和電融合的基本操作過(guò)程3. 觀察動(dòng)物細(xì)胞融和過(guò)程中細(xì)胞的行為和變化【實(shí)驗(yàn)原理】A. 細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合是指在自發(fā)或者誘導(dǎo)條件下，兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并為雙核或者多核細(xì)胞的過(guò)程。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合，包括病毒誘導(dǎo)融合、化學(xué)誘導(dǎo)融和和電激誘導(dǎo)融合。1.病毒誘導(dǎo)融合仙臺(tái)病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導(dǎo)細(xì)胞的融合。這類病毒的被膜中有融合蛋白，可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合，同時(shí)也可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生融合。但該法由于病毒的滅活較為復(fù)雜，故實(shí)驗(yàn)室多不采用

2、此法用于細(xì)胞的融合。2.化學(xué)誘導(dǎo)融合 很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合，如聚乙二醇()、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細(xì)胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細(xì)胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過(guò)程中想接觸的細(xì)胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細(xì)胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合。化學(xué)誘導(dǎo)方法，操作方便，誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動(dòng)、植物細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性。PEG是廣泛使用的化學(xué)融合劑。3.電激誘導(dǎo)融合 包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)是先使細(xì)胞在電場(chǎng)中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊破細(xì)

3、胞膜，細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細(xì)胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融合過(guò)程易控制、融合概率高、無(wú)毒性、作用機(jī)制明確、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。B. PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，為一系列不同相對(duì)分子量的多聚體。相對(duì)分子質(zhì)量在200-6000均可用作細(xì)胞融合劑。普遍認(rèn)為聚乙二醇分子能與水分子借氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜由于脫水而膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂 類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合：細(xì)胞融合率是指在顯微鏡 的一個(gè)視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞核總數(shù)與該視

4、野內(nèi)所有細(xì)胞(包括已融合的細(xì)胞)的細(xì)胞核總數(shù)之比，通常以百分比表示。該方法的優(yōu)點(diǎn)是：用法簡(jiǎn)單，容易獲得融合體，融合效果好。實(shí)驗(yàn)室常用分子量為400-6000D的PEG用于動(dòng)物細(xì)胞的融合，動(dòng)物細(xì)胞的融合受到很多外界因素的影響，如：PEG的濃度，作用時(shí)間，PH等。一般來(lái)說(shuō)，PEG相對(duì)分子量越大，融合效果越好，而PEG的濃度通常為40%60%。PEG的作用時(shí)間通常為：15min,作用溫度為：3840，常使用GKN液將溶液的PH調(diào)節(jié)至8.08.2。同時(shí)GKN液還可以調(diào)節(jié)動(dòng)物細(xì)胞的滲透壓從而使細(xì)胞保持一定的形態(tài)。【實(shí)驗(yàn)用品】1. 材料雞血紅細(xì)胞；2. 試劑50%PEG、GKN液（NaCl 8g，KCl

5、0.4g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖 2g，酚紅 0.01g，溶于1000ml雙蒸水）、Alsevers細(xì)胞保存液、0.85%氯化鈉溶液；3. 器材顯微鏡、離心機(jī)、燒杯、載玻片、蓋玻片、離心管（帶刻度）、液體混合器、膠頭滴管、廢液缸等?！静僮鞑襟E】1. 雞血紅細(xì)胞的制備與保存用無(wú)菌注射器抽取Alsevers細(xì)胞溶液2ml，再?gòu)碾u翼下靜脈取血2ml，取出后至于離心管中再加入6mlAlsevers細(xì)胞溶液，混勻并封口，至于4的冰箱中保存。2. PEG誘導(dǎo)融合1) 取雞血1ml+4ml 0.85%的NaCl溶液，在1200r/

6、min的離心機(jī)內(nèi)離心5分鐘。2) 將離心后的溶液，去上清液后，剩余。在沉降血球中，加入GKN液至4ml，使之成每毫升含血球15000萬(wàn)個(gè)，即15x103 個(gè)/ml。3) 取上述1ml加0.5ml 60%的PEG液，先靜置使之呈明顯的分層3min,然后用液體混合器將液體混勻，停留1-2分鐘，即可鏡下觀察。4) 取上述制備的液體約半滴于載玻片上，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察，觀察時(shí)注意找不同融合時(shí)期的融合細(xì)胞進(jìn)行觀察與拍攝。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示：圖2兩個(gè)細(xì)胞發(fā)生部分融合圖1兩個(gè)細(xì)胞開(kāi)始接觸圖4兩個(gè)細(xì)胞完全融合圖3兩個(gè)細(xì)胞絕大多數(shù)部位發(fā)生融合【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與注意事項(xiàng)】1. 制備的雞血紅細(xì)胞懸液的濃度

7、不宜過(guò)高，否則細(xì)胞容易聚集，融合效果受影響。濃度可根據(jù)集體細(xì)胞情況調(diào)節(jié)。PEG的分子量應(yīng)為400-6000之間，PEG溶液濃度為40%-60%，融合時(shí)間為1-5分鐘。若超過(guò)以上三個(gè)條件，可能超過(guò)了細(xì)胞膜的自我修復(fù)限度，導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，無(wú)法修復(fù)；若低于以上三個(gè)條件，可能細(xì)胞的破損程度較低，不能進(jìn)行融合。2. 溶液的pH值：8.0-8.2，可采用緩沖液。溫度為：38-40。適當(dāng)?shù)靥岣邷囟瓤梢允辜?xì)胞融合得更充分，但溫度不能過(guò)高，以免細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)變性。3從試管中提取溶液時(shí)，最好使用注射器，不宜污染試管而且容易控制。4. 切記:加入PEG時(shí)，應(yīng)該先反應(yīng)后搖勻，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞融合不充分。【思考題】1.

8、 思考細(xì)胞融合的理論和實(shí)際意義（1） 理論：主要利用了質(zhì)膜的流動(dòng)性和自動(dòng)修復(fù)功能。（詳細(xì)理論見(jiàn)）（2） 實(shí)際意義：細(xì)胞融合不僅可用于基礎(chǔ)研究，而且還有重要的應(yīng)用價(jià)值，在植物育種方面已經(jīng)成功的有蘿卜+甘藍(lán)、粉藍(lán)煙草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等。細(xì)胞融合另一個(gè)重要應(yīng)用就是制備單克隆抗體，單克隆抗體可以用作診斷試劑，治療疾病和運(yùn)載藥物，具有準(zhǔn)確，高效，簡(jiǎn)易，快速等優(yōu)點(diǎn)?！靖健考?xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用一、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合是從細(xì)胞水平來(lái)改變動(dòng)物細(xì)胞的遺傳性，用于生產(chǎn)單克隆抗體、疫苗等特定的生物制品。培育動(dòng)物新品種，縮短動(dòng)物的育種過(guò)程，動(dòng)物細(xì)胞融合的應(yīng)用范圍已廣及生物學(xué)的各個(gè)分支學(xué)科，可別是在繪制人

9、類基因圖譜方面取得了顯著成就。雖然細(xì)胞雜交屬于理論生物學(xué)范疇，但是在實(shí)際應(yīng)用方面也有重大突破。在基礎(chǔ)理論研究上，動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)對(duì)于研究細(xì)胞分化、基因定位、腫瘤發(fā)生機(jī)制等方面都有重要意義。在實(shí)際應(yīng)用方面，動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)在藥物定向釋放系統(tǒng)、細(xì)胞治療以及抗腫瘤免疫等方面起到重要的作用。1. 用于生產(chǎn)單克隆抗體只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridoma cell)，雜交瘤細(xì)胞既能像骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體

10、技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)。中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所研制成功抗北京鴨紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，同時(shí)還與有關(guān)醫(yī)學(xué)部門合作，成功地制備了抗人肝癌和肺癌的單克隆抗體。2. 用于基因定位和繪制人類基因圖譜雜種細(xì)胞中某一染色體或其片段的存在與否與細(xì)胞的某一性狀表達(dá)與否相聯(lián)系，從而可以實(shí)現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。3. 用于動(dòng)物育種體細(xì)胞核移植技術(shù)是將細(xì)胞核移植到另一細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的生物技術(shù)。動(dòng)物體細(xì)胞融合后，雜種細(xì)胞難以發(fā)育再生為一個(gè)個(gè)體。但借助于細(xì)胞核移植的方法將融合后雜種細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育新的雜種。另外，細(xì)胞核移植技術(shù)的建立，還為目前進(jìn)行的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基

11、因技術(shù)做了良好的鋪墊。4. 用于細(xì)胞療法將患者的任何體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合，融合子進(jìn)行有絲分裂形成囊胚，囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是多能干細(xì)胞，對(duì)多能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植，不僅解決了器官和組織來(lái)源問(wèn)題，而且也避免宿主對(duì)外來(lái)物的免疫排斥。5. 動(dòng)物體細(xì)胞融合在基礎(chǔ)理論研究方面的作用在這方面，細(xì)胞融合主要用于研究細(xì)胞核質(zhì)關(guān)系和個(gè)體發(fā)育，解釋疾病的發(fā)生機(jī)制和膜蛋白動(dòng)力學(xué)研究。二、植物細(xì)胞融合技術(shù)植物細(xì)胞融合技術(shù)目前主要是作為擴(kuò)大變異的手段，同時(shí)也朝著將抗藥性和胞質(zhì)雄性不育等細(xì)胞基質(zhì)基因?qū)肓硪粋€(gè)體細(xì)胞的方向發(fā)展，有可能形成新的核質(zhì)雜種。如果獲得了有用性狀的細(xì)胞系，在還不能

12、形成植株時(shí)，就可以通過(guò)快速大量繁殖細(xì)胞加以利用。1. 在生產(chǎn)研究方面植物細(xì)胞融合在育種上有重要的應(yīng)用價(jià)值，在生產(chǎn)研究應(yīng)用方面，通過(guò)誘導(dǎo)不同種屬間甚至不同科間原生質(zhì)體的融合，可能打破有性雜交不親和性的界限，廣泛地組合各種基因型，從而有可能形成有性雜交方法所無(wú)法獲得的新型雜交植株。2. 運(yùn)用于外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體植物細(xì)胞融合可以將細(xì)胞器、DNA、質(zhì)粒、病毒、細(xì)菌等外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體，從而有可能引起細(xì)胞遺傳性的改變，為某些珍稀動(dòng)物的復(fù)壯等提供了可行的方法，應(yīng)用于植物育種、種質(zhì)保存、無(wú)性系的快速繁殖和有用物質(zhì)生產(chǎn)等等。三、微生物細(xì)胞融合技術(shù)用于植物和微生物育種是細(xì)胞融合技術(shù)最基本的應(yīng)用領(lǐng)域，對(duì)微生物而言，該技術(shù)主要用于改良微生物菌種特性，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，使菌種獲得新的性狀，合成新產(chǎn)物等。1. 微生物細(xì)胞融合技術(shù)的對(duì)象在目前，微生物細(xì)胞融合的對(duì)