基因工程之微生物知識(shí)競(jìng)賽

1、基因工程之基因工程之 微生物知識(shí)競(jìng)賽微生物知識(shí)競(jìng)賽為了治理石油泄漏，美國(guó)科學(xué)部門利用基因工程技為了治理石油泄漏，美國(guó)科學(xué)部門利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)了一種能分解大部分烴類的微生物，他們是術(shù)生產(chǎn)了一種能分解大部分烴類的微生物，他們是怎么做到的？怎么做到的？答:將能分解己烷，辛烷和癸烷，降解二甲苯和甲苯，降解萘和分解樟腦的四種假單胞桿菌的不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一假單胞菌種，獲得超級(jí)細(xì)菌。該細(xì)菌能在幾小時(shí)內(nèi)降解掉海上溢油中三分之二的烴類。為什么漫畫中的兩個(gè)細(xì)菌不怕抗生素？他們形成的原理是什么？因?yàn)樗麄兙哂锌股乜剐?。使用大量抗生素進(jìn)行篩選和基因工程對(duì)細(xì)菌進(jìn)行突變是這種細(xì)菌產(chǎn)生的原因，而基因突變是產(chǎn)生此類細(xì)菌的根

2、本原因。但在自然狀況下，變異菌在不同微生物的生存斗爭(zhēng)中未必處于優(yōu)勢(shì)地位，較易被淘汰?？股氐臑E用則是這類細(xì)菌今日如此盛行的導(dǎo)火線，由于人類濫用抗生素，使得原平衡中的優(yōu)勢(shì)種被淘汰，而這種“抗抗生素”的細(xì)菌則順利成長(zhǎng)的成為了優(yōu)勢(shì)種，取得了生存斗爭(zhēng)的優(yōu)勢(shì)地位，從而得以大量繁衍、傳播。世界上存在各式各樣的微生物，在基因世界上存在各式各樣的微生物，在基因工程中常應(yīng)用的工程中常應(yīng)用的微生物微生物有哪些？有哪些？答：大腸桿菌，根瘤農(nóng)桿菌，噬菌體，酵母菌等。答：答： (1) (1)削減分子量削減分子量( (除去非必需區(qū)和整合區(qū)除去非必需區(qū)和整合區(qū)) )； (2) (2)削減酶切位點(diǎn)；削減酶切位點(diǎn)； (3) (

3、3)添加選擇標(biāo)記；添加選擇標(biāo)記； (4) (4)引入終止突變。引入終止突變。 如何將野生型的噬菌體改造成為一個(gè)理想如何將野生型的噬菌體改造成為一個(gè)理想的載體的載體? 答：為了擴(kuò)增突變體的答：為了擴(kuò)增突變體的 thyA thyA基因，先設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其基因，先設(shè)計(jì)一對(duì)引物，其中一個(gè)引物的序列與中一個(gè)引物的序列與 thyA thyA基因基因 的的55端相同，另一個(gè)引物端相同，另一個(gè)引物同該基因的同該基因的 3 3端互補(bǔ)。在引物的端互補(bǔ)。在引物的 5 5端加上合適端加上合適類限類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，以便于后來(lái)的克隆。將染色制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，以便于后來(lái)的克隆。將染色體體 DNA DNA

4、同引物混合后，進(jìn)行同引物混合后，進(jìn)行 PCR PCR擴(kuò)增。然后進(jìn)行瓊脂糖凝擴(kuò)增。然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴(kuò)增片段，可以直接測(cè)序或克隆到合適的載膠電泳，純化擴(kuò)增片段，可以直接測(cè)序或克隆到合適的載體再測(cè)序。體再測(cè)序。 假定你分離到一個(gè)假定你分離到一個(gè) E Ecoli coli 的的 Thy- Thy-突變體，并推測(cè)突變體，并推測(cè)有可能是有可能是 ThyA ThyA 基因突變。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)方案用基因突變。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)方案用 PCR PCR 從從染色體染色體DNADNA擴(kuò)增突變的擴(kuò)增突變的 ThyA ThyA 基因，測(cè)定突變的序列。基因，測(cè)定突變的序列。( (注：注：E Ecoli coli 野生型的

5、野生型的 ThyA ThyA 基因的序列是已知的基因的序列是已知的) )小丁用藍(lán)白斑做陽(yáng)性克隆篩選小丁用藍(lán)白斑做陽(yáng)性克隆篩選, ,因?yàn)槭韬鰶](méi)有在選擇性因?yàn)槭韬鰶](méi)有在選擇性培養(yǎng)基中添加培養(yǎng)基中添加X(jué)-gal,X-gal,結(jié)果長(zhǎng)出的菌斑全為白色結(jié)果長(zhǎng)出的菌斑全為白色試問(wèn)：試問(wèn)：（1 1）這些白斑是否全為陽(yáng)性克?。┻@些白斑是否全為陽(yáng)性克隆, ,形成白斑的原理是形成白斑的原理是什么？什么？（2 2）如果不是）如果不是, ,通過(guò)哪些方法可以從這些白斑中選擇通過(guò)哪些方法可以從這些白斑中選擇真正陽(yáng)性克隆？真正陽(yáng)性克隆？答：（答：（1 1）不是）不是. .因?yàn)闆](méi)有生色底物因?yàn)闆](méi)有生色底物x-gal,x-gal

6、,陰性菌落雖然可以表達(dá)陰性菌落雖然可以表達(dá)lacZ,lacZ,但無(wú)但無(wú)法顯色法顯色. .（2 2）A)A)全部影印至含全部影印至含X-galX-gal的新鮮選擇培養(yǎng)基上的新鮮選擇培養(yǎng)基上, ,培養(yǎng)后看是否為白色培養(yǎng)后看是否為白色. . B) B)以以pcrpcr法對(duì)所有菌落作鑒定法對(duì)所有菌落作鑒定. . C) C)所有菌落轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基擴(kuò)增后抽質(zhì)粒所有菌落轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基擴(kuò)增后抽質(zhì)粒, ,看質(zhì)粒大小看質(zhì)粒大小. .小李家的土地由于長(zhǎng)期種植小麥，沒(méi)進(jìn)行小李家的土地由于長(zhǎng)期種植小麥，沒(méi)進(jìn)行輪作，土地嚴(yán)重缺氮，如何利用基因工程輪作，土地嚴(yán)重缺氮，如何利用基因工程手段在盡量短的時(shí)間里讓小李家的土地恢

7、手段在盡量短的時(shí)間里讓小李家的土地恢復(fù)正常生產(chǎn)？復(fù)正常生產(chǎn)？答： 利用基因工程手段對(duì)根瘤菌進(jìn)行遺傳改造，如引入多拷貝的固氮酶的正調(diào)控基因nifA基因，或在該基因上游加入增強(qiáng)子和強(qiáng)啟動(dòng)子。大幅提高根瘤菌的固氮作用。（美國(guó)已有在基因組中整合了外源dctABD基因的轉(zhuǎn)基因苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti)能大幅提高固氮能力和大田苜蓿產(chǎn)量，并已通過(guò)遺傳工程安全性評(píng)價(jià)進(jìn)入商品化生產(chǎn)。）（我國(guó)也有重組大豆根瘤菌HN2已通過(guò)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)審批進(jìn)行環(huán)境釋放。小李家開的發(fā)酵工廠生產(chǎn)菌株經(jīng)常因噬菌體小李家開的發(fā)酵工廠生產(chǎn)菌株經(jīng)常因噬菌體“感染感染”而不能正常生產(chǎn)，小李很苦惱，頭發(fā)

8、而不能正常生產(chǎn)，小李很苦惱，頭發(fā)都快愁白了。在排除了外部感染的可能性后有都快愁白了。在排除了外部感染的可能性后有人認(rèn)為是由于溶源性菌裂解所致，小李想問(wèn)你人認(rèn)為是由于溶源性菌裂解所致，小李想問(wèn)你的看法如何？可以幫他設(shè)計(jì)個(gè)實(shí)驗(yàn)證明一下嗎的看法如何？可以幫他設(shè)計(jì)個(gè)實(shí)驗(yàn)證明一下嗎? ?答：溶源菌是指在核染色體組上整合有前噬菌體并能正常生長(zhǎng)繁殖而不被裂解的細(xì)菌（或其他微生物），具有自發(fā)裂解、誘導(dǎo)、免疫性、復(fù)愈、溶源轉(zhuǎn)變等特性。檢驗(yàn)方法是將適量發(fā)酵液與大量的敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所釋放的溫和噬菌體會(huì)發(fā)生裂解性生活周期者）相混合，然后加至瓊脂培養(yǎng)基中倒一平板。過(guò)一段時(shí)間后溶源菌就長(zhǎng)成菌落。由于在溶源菌

9、分裂過(guò)程中有極少數(shù)個(gè)體會(huì)發(fā)生自發(fā)裂解，其釋放的噬菌體可不斷侵染溶源菌菌落周圍的指示菌菌苔，所以會(huì)產(chǎn)生一個(gè)個(gè)中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌LBA4404LBA4404的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化 凍融法凍融法1)1)將將1l1l構(gòu)建好的植物表達(dá)載體質(zhì)粒加入到構(gòu)建好的植物表達(dá)載體質(zhì)粒加入到100 l100 l農(nóng)桿菌感農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置30min30min；2)2)于液氮中速凍于液氮中速凍2-3min2-3min，3737溫浴溫浴3min3min；3)3)加入加入500l 500l 無(wú)抗生素的無(wú)抗生素的YEPYEP液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基，

10、2828輕搖輕搖2 24h4h，消除感受態(tài)；消除感受態(tài)；4)4)從該培養(yǎng)物中取從該培養(yǎng)物中取5050200l200l菌液均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的菌液均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的YEPYEP選擇平板（選擇平板（Rif R , Str R ,Km RRif R , Str R ,Km R）上，）上，2828倒置培養(yǎng)兩天。倒置培養(yǎng)兩天。上述為小胖同學(xué)做農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟，為什么在第二步中他要放上述為小胖同學(xué)做農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟，為什么在第二步中他要放入液氮中速凍入液氮中速凍2-3min2-3min呢？呢？答：與大腸桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)熱激原理相同，為轉(zhuǎn)化反應(yīng)提供一個(gè)低溫環(huán)境，使轉(zhuǎn)化效率更高。為什么外源為什么外源DNADN

11、A難以轉(zhuǎn)化野生型的微生物難以轉(zhuǎn)化野生型的微生物受體細(xì)胞？受體細(xì)胞？答：野生型細(xì)菌有針對(duì)外源DNA的限制和修飾系統(tǒng)，外源DNA會(huì)被識(shí)別，從而被降解，要選擇限制系統(tǒng)缺陷型的受體細(xì)胞（限制缺陷型）；外源基因克隆、擴(kuò)增以及表達(dá)是建立在DNA重組分子自主復(fù)制的基礎(chǔ)上的，受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的受體細(xì)胞（重組缺陷型）；用于基因工程的受體細(xì)胞必須對(duì)重組DNA分子具有較高的可轉(zhuǎn)化性，利用遺傳誘變技術(shù)改變受體細(xì)胞壁的通透性，從而提高其轉(zhuǎn)化率（轉(zhuǎn)化親和型）什么叫微生物農(nóng)藥？什么叫微生物農(nóng)藥？微生物農(nóng)藥（microbial pesticide）包括農(nóng)用抗生素和活體微生物農(nóng)藥。為利用微生物或其代謝產(chǎn)物來(lái)防治危害農(nóng)作物的病、蟲、草、鼠害及促進(jìn)作物生長(zhǎng)。它包括以菌治蟲、以菌治菌、以菌除草等。這類農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)，對(duì)人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全，不傷害天敵，不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)。這些微生物農(nóng)藥包括細(xì)菌、真菌、病毒或其代謝物，例如蘇云金桿菌、白僵菌、核多角體病毒、井岡霉素、C型肉毒梭菌外毒素等。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)越來(lái)越高的要求，微生物農(nóng)藥無(wú)疑是今后農(nóng)藥的發(fā)展方向之一。近幾年，人體微生物在癌癥治療領(lǐng)域的研究逐漸近幾年，人體微生物在癌癥治療領(lǐng)域的研究逐漸興起。微生物可以通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境、預(yù)測(cè)癌興起。微生物可以通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境、預(yù)測(cè)癌癥風(fēng)險(xiǎn)、引發(fā)癌癥刺激免疫