銀染聚丙烯酰胺檢測牙鲆微衛(wèi)星DNA實驗方法的分析探討

1、銀染聚丙烯酰胺檢測牙鲆微衛(wèi)星DNA實驗方法的分析探討杜爽 楊磊 仇雪梅摘要：為了篩選和檢測牙鲆種群中具有較好表現(xiàn)的微衛(wèi)星多態(tài)性,對聚丙烯酰胺凝膠及銀染方法進行了選擇。經(jīng)過反復(fù)的實驗，總結(jié)出了一套適用于牙鲆微衛(wèi)星檢測的方法。該方法具有靈敏度高、背景淺、污染小、條帶清晰等突出特點,能有效地控制染色背景,顯著提高檢測分辨率,整個染色過程所需時間短,具有廣泛的推廣價值。關(guān)鍵詞:銀染;微衛(wèi)星;聚丙烯酰胺凝膠微衛(wèi)星DNA(microsatellite ) 又稱簡單序列重復(fù)(Sample Sequence Repeats ,SSR) ，一般以16 個堿基為核心序列，經(jīng)過多次的串聯(lián)重復(fù)組成的長達幾十個核苷酸的

2、序列1。與其它分子標記相比，微衛(wèi)星標記具有的優(yōu)點:微衛(wèi)星標記具有座位數(shù)目巨大并隨機分布于基因組中(內(nèi)含子、外顯子、基因間序列)、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳方式、分析方法簡單、重復(fù)性好和近緣種中引物通用性高等優(yōu)點,在動物的群體遺傳分析、親子鑒定、基因組作圖和遺傳育種中得到了廣泛的應(yīng)用2 3。微衛(wèi)星PCR 產(chǎn)物的檢測方法主要有熒光標記引物的測序法,同位素標記引物的聚丙烯酰胺電泳法,以及銀染變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠方法。目前很多國內(nèi)外的實驗室都是通過PAGE-銀染的方法來鑒定微衛(wèi)星產(chǎn)物。在魚類微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物的鑒定中，變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠方法都有所報道4 5。本次實驗，我們在應(yīng)用微衛(wèi)星標記對牙鲆

3、群體的檢測工作中,對銀染聚丙烯胺凝膠電泳技術(shù)的最適條件進行了探索,經(jīng)過多次實驗,最終研究找到了其最適條件，可以對牙鲆微衛(wèi)星DNA擴增產(chǎn)物進行更為準確、可靠的鑒定分析。1. 材料和方法1.1 材料1.1.1 樣本大連海域牙鲆群體30尾,取其肌肉加入70%乙醇后放入-20保存?zhèn)溆谩?.1.2 微衛(wèi)星引物從NCBI上下載牙鲆微衛(wèi)星序列，經(jīng)過Primer 5設(shè)計引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成引物，并按照說明溶解引物。1.2 方法1.2.1 基因組DNA的提取采用文獻6 的酚、氯仿法抽提牙鲆的基因組DNA ,得到的DNA加TE溶解后置-20 冰箱中備用。1.2.2 PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25

4、ul，內(nèi)含100ng的模板DNA，0.4umol/L的dNTPs，1.5mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，0.25ulTapDNA聚合酶（Promega）。反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler PCR擴增儀上進行。PCR反應(yīng)為30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94變性35s，退火30s，72延伸40s；首次循環(huán)前預(yù)變性5min，最后一次循環(huán)結(jié)束后72再延伸5min。1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠的配制1.2.3.1 變性聚丙烯酰胺凝膠的配制表一 不同濃度變性聚丙烯酰胺凝膠的配方藥品與試劑 濃度 6% 濃度 4%尿素 12.6 (g) 12.6 (g) 雙蒸水 14.5 m

5、l 16 ml 10×TBE 1.5ml 1.5 ml40%丙烯酰胺溶液(38:2) 4.5ml 3ml 10%過硫酸胺溶液 200l 200l TEMED 15l 15l 總體積 30ml 30 ml1.2.3.2 非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制表二 不同濃度非變性聚丙烯酰胺凝膠的配方藥品與試劑 濃度 8% 濃度 10% 濃度12%30%丙烯酰胺溶液(29:1) 8ml 10ml 12 ml5×TBE 6ml 6 ml 6ml雙蒸水 16ml 14ml 12 ml10%過硫酸胺溶液 200l 200l 200lTEMED 15l 15l 15l總體積 30ml 30 ml 3

6、0ml1.2.4 銀染液的配制固定液: 10%的乙醇溶液染色液:0. 1%AgNO3溶液和0.2% AgNO3溶液, 對比效果顯色液: 為對比效果,采用兩種顯色液配方第一種配方: 2g NaOH, 0.1g Na2CO3,加雙蒸水到250ml, 在加入800l 甲醛7第二種配方: 30g Na2CO3、1.5mL 37%甲醛、0.2mL Na2S2O3(10mg/mL),加雙蒸水至1000mL81.2.5 銀染法的操作步驟固定10min 水洗2次(每次30秒) 染色15min 水洗3次(每次不超過30s) 顯色(條帶清晰即可) 終止。2.結(jié)果2.1 非變性膠與變性PAGE膠的對比在凝膠電泳鑒定

7、微衛(wèi)星產(chǎn)物的過程中,變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠法都有使用。雖然兩種PAGE膠檢測基因型結(jié)果完全一致,但有實驗表明，兩種PAGE膠在條帶分離效果上略有區(qū)別9。本次實驗對這兩種PAGE膠做了選擇比較，結(jié)果如圖一、二M 1 2 3 4非特異性帶非特異性帶目標帶圖一 10%非變性PAGE膠M 1 2 3 4非特異性帶非特異性帶目標帶圖二 6%變性PAGE膠從圖中可以看出，非變性PAGE膠和變性PAGE膠都能清楚的顯示目標帶，且基因型相同。但是非變性PAGE膠帶型要比變性PAGE膠好，更清楚。而且變性PAGE膠制膠過程比非變性PAGE膠復(fù)雜，操作繁瑣。2.2 不同濃度的非變性PAGE膠的對比按照表二分別

8、配制8%、10%、12%的非變性PAGE膠用相同的PCR擴增產(chǎn)物分別點到三板不同濃度的膠上, 上樣量為6ul (其中上樣buffer 5l, PCR擴增產(chǎn)物1l)，1×TBE，140V恒壓電泳5個小時(如圖三,四)。5， 4， 3， 2， 1， M 1 2 3 4 5 圖三 12%非變性PAGE膠 圖四 8%非變性PAGE膠從圖中可以看出濃度為12%的PAGE膠條帶較8%的清楚，10%、12%的沒有什么明顯差別。但由于12%的濃度大，電泳時間長，所以選擇濃度10%的聚丙烯酰胺膠。2.3 銀染方法的比較2.3.1 染色液的選擇將一板聚丙烯酰胺膠的點樣孔左右兩部分分別點上相同的PCR擴增

9、產(chǎn)物，固定后將膠一分為二，分別放入0.1%和0.2 %的AgNO3溶液中，染色15分鐘，加入相同顯色液后，觀察其結(jié)果。結(jié)果顯示，0.2 %的AgNO3溶液反應(yīng)靈敏，5分鐘就會顯現(xiàn)條帶，但是背景較深，略帶墨綠色；0.1%AgNO3溶液12分鐘顯帶，雖然顯色時間比0.2 %的長，但背景較淺，呈現(xiàn)淡黃色。2.3.2 顯色液的選擇將一板聚丙烯酰胺膠的點樣孔左右兩部分分別點上相同的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)過固定、染色后，將膠一分為二，分別放入兩種不同的顯色液中（顯色液配方見1.2.4）。經(jīng)過反復(fù)的實驗發(fā)現(xiàn)，兩種顯色液都能顯現(xiàn)清晰的條帶，但第一種染色液靈敏度高，顏色略淺一些，而且所用試劑價格比較便宜。3討論3.

10、1 對非特異性條帶的思考聚丙烯酰胺凝膠的分辨率高，理論上能分開長度相差0.1%的DNA分子，但實際操作中，受到很多因素的影響。在銀染后的凝膠上除看到主帶外,還常伴隨著出現(xiàn)一些顯色較淺的非特異性帶,且不同的引物產(chǎn)生的非特異性帶不同。關(guān)于其的機制,Murray10等認為是DNA 鏈復(fù)制過程中的滑動錯配造成的。非特異性帶的產(chǎn)生與模板和引物質(zhì)量、退火溫度、dNTP濃度、Taq DNA聚合酶的量、循環(huán)次數(shù)等諸多因素有關(guān)。本人通過多方面的摸索, 覺得減少循環(huán)次數(shù)，相對升高一些退火溫度和減少Taq DNA聚合酶的量是最有效的辦法。通過改變這些條件，取得了良好的效果,有時非特異性帶不能完全消除,但是它不會影響

11、等位基因的判定,因為在某特定的位點上, 非特異性帶的帶型通常是固定的,并且銀染后主帶比非特異性帶清晰、易讀。3.2 非變性膠與變性PAGE膠的選擇曲魯江等9在對雞的研究中發(fā)現(xiàn)，變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠對微衛(wèi)星產(chǎn)物進行電泳時，二者對同一微衛(wèi)星PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果有較大的差別,在非變性凝膠中條帶過于復(fù)雜,出現(xiàn)的非特異性條帶極大的影響了分析帶形的準確性,從而使實驗結(jié)果的誤差大大加大。但是在本研究中，對同一微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物進行了比較，并沒有發(fā)現(xiàn)較大的差別，都存在非特異性條帶。而且非變性PAGE膠顯示條帶的結(jié)果比變性PAGE膠的效果好。分析原因可能是研究對象不同，所以在分析結(jié)果上有所區(qū)別。3.3 染

12、色方法的探討聚丙烯酰胺凝膠電泳后，可以用溴化乙錠（EB）染色。由于EB染色的靈敏度不夠高，對微量DNA片段的分析不太適用。另外，EB是致癌物，給實驗操作帶來很多不必要的麻煩。因此，本次研究采用銀染的方法。該法既經(jīng)濟、簡便、快速、靈敏,又具有無污染、分辨率高、結(jié)果可永久保存等優(yōu)點，是一種檢測微量DNA的理想方法11。在實驗中有時也會遇到條帶不清楚、背景發(fā)黃，顏色過深等問題。這與AgNO3溶液的濃度，顯色液的配制，清洗水的質(zhì)量、染色時間的長短等有關(guān)。在實際進行實驗時，要摸索條件，使其達到最佳狀態(tài)。4結(jié)論本人經(jīng)過多次實驗發(fā)現(xiàn)，采用10%的非變性聚丙烯酰胺膠，0.1%的AgNO3溶液染色15分鐘,2g

13、 NaOH, 0.1g Na2CO3,加雙蒸水到250ml, 在加入800l 甲醛作為顯色液，這種方法對于牙鲆微衛(wèi)星的分離最為有效。5參考文獻1 Beckmann J S , Soller M. Toward a Unified approach to genetic mapping of evkaryotes based on sequence tagged microsatellite sites J . Bio Technology , 1990 , 8 : 930 - 932.2 Pang , Ritland , Carlson , et al . Japanese quail mic

14、rosatellite loci amplified with chicken-specific primers J . Animal Genetics , 1999 , 30 : 195 - 199.3 OConnell M , Wright J M. Microsatellite DNA in fishes J . Reviews in Fish Biology and Fisheries , 1997-7 : 331-363. 4 朱彩艷 , 葉衛(wèi), 夏軍紅,鯪微衛(wèi)星引物的鑒定及其適用性檢驗，南方水產(chǎn)，2007，3（2），15-195 匡友誼,佟廣香,尹家勝, 呼瑪河哲羅魚遺傳多樣性的A

15、FLP 分析，中國水產(chǎn)科學，2007，14（4）：615-6216J . 薩姆布魯克,D. W. 拉塞爾著1 黃培堂等譯. 分子克隆實驗指南 M . 第3 版. 北京:科學出版社,2002. 467 - 470.7 SANGUINETTI C J,DIAS NETO E,SIMPSON A J. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels J. Biotechniques, 1994, 17(5):914- 921.8 BASSAM B J, CAETANO- ANOLLES G,GRESSHOFF P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacryamid gels J. Anal Biochem, 1991, 196:80- 83.9 曲魯江，李顯耀,杜志強，微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物變性與非變性PAGE銀染檢測方法的比較，遺傳， 2004，26 (4) :522524 10 MURR