淫羊藿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

1、淫羊藿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用               作者：熊平源 郭凱文 唐朝輝 白惠卿【關(guān)鍵詞】  淫羊藿；,T淋巴細(xì)胞；,IL摘  要：  目的：探討淫羊藿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法：采用 3HTdR標(biāo)記法，測定淫羊藿對NK細(xì)胞毒活性的影響及淫羊藿對ConA誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性影響；通過ELISA法測定淫羊藿對小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL2的影響；利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測淫羊藿對T淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8、CD

2、4 / CD8陽性細(xì)胞百分率的影響。結(jié)果：中、高劑量組均能增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(P0.01）；中、高劑量組均能增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性(P0.01）；各劑量組均能增強(qiáng)脾細(xì)胞IL2的產(chǎn)生（P0.01）；各劑量組CD8陽性細(xì)胞百分率明顯降低， CD4 / CD8陽性細(xì)胞百分率顯著提高(P0.01）。結(jié)論: 淫羊藿對小鼠免疫功能有明顯的調(diào)節(jié)作用。關(guān)鍵詞：  淫羊藿；  T淋巴細(xì)胞；  IL2；  NK細(xì)胞  淫羊藿（Epimedium Kereanum Nakai）具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效。淫羊藿藥用歷史悠久 ,來源于小檗

3、科淫羊藿屬的多種植物。李時(shí)珍在本草綱目中稱其有“益精氣、堅(jiān)筋骨、補(bǔ)腰膝、強(qiáng)心力”之功效?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明 ,淫羊藿能增加心腦血管血流量 ,促進(jìn)造血功能、免疫功能及骨代謝 ,具有抗衰老、抗腫瘤等功效。本研究通過小鼠NK細(xì)胞活性測定試驗(yàn)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、IL2活性測定試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)測定試驗(yàn)等以進(jìn)一步了解淫羊藿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。1  材料Ba1b/c品系小鼠，體重1822g，雌雄各半，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。淫羊藿由中藥店購置。ConA為Sigma公司產(chǎn)品，3HTdR由中國科學(xué)院原子能研究院同位素研究所提供，小鼠IL2 ELISA試劑盒為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。N

4、K敏感細(xì)胞株Yac1細(xì)胞由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系提供。流式細(xì)胞儀：FACS Can 型，是美國BactonDickson 公司產(chǎn)品。2  方法與結(jié)果  100%藥液的制備：取干燥生藥20g，加水100200ml，置冰箱中24h，然后將水浸生藥武火煮沸，并以文火煎煮，維持30min，用紗布粗濾，留濾液，再將殘?jiān)盟?00200ml煎煮30min，再濾除殘?jiān)?。兩次濾液合并，濃縮至20ml，即每ml含藥量1g，調(diào)pH至7.4，再以1500rpm離心15min，取上清液備用1。小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。正常對照組：每只每日用0.25ml生理鹽水連續(xù)灌胃10d;造模對照組：給予

5、60CO照射造模，一次性 60CO 射線400 rad全身照射，劑量率213.93倫/min，時(shí)間103 s1;藥物實(shí)驗(yàn)組：同等條件下一次性 60CO 射線照射后藥物I組給予淫羊藿1g /（kg.d）體重，連續(xù)灌胃10d;藥物II組給予淫羊藿10g /（kg.d）體重，連續(xù)灌胃10d;藥物III組給予淫羊藿50g /（kg.d）體重，連續(xù)灌胃10d2。21  NK細(xì)胞活性測定試驗(yàn)取Yac1細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞懸液各50l（效靶比為100:1），加入96孔培養(yǎng)板中，再加入0.1ml培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞對照,置375%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。滲入0.5Ci/20mld的3HTdR，培

6、養(yǎng)6h后收獲。用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集于纖維素濾膜上，用蒸餾水反復(fù)沖洗，再滴加50.0g/L三氯醋酸2ml，使樣品固定，無水乙醇2ml流洗脫色后，置于80烘箱內(nèi)干燥30min。將烘干的濾膜放入盛有5ml閃爍液的測量杯中，置于液體閃爍儀中測Cpm值。每份樣品設(shè)三個(gè)復(fù)孔2,4,6。結(jié)果見表1。表1  淫羊藿對NK細(xì)胞活性的影響（略）表1結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共同培養(yǎng)6h后，藥物組和藥物組與造模對照組比較，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性均明顯增強(qiáng)（P0.01）。22  淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 將小鼠脫頸椎處死，無菌取脾、剪碎、研磨、過濾，用含10%小牛血清的IMDM培

7、養(yǎng)液制備脾細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。取100l于96孔培養(yǎng)板中，加入10.0g/mlConA，每孔終體積為200l。37培養(yǎng)48h后加入 3HTdR 2lCi/孔，繼續(xù)培養(yǎng)12h后收獲。用多頭細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于纖維素濾膜上，用蒸餾水反復(fù)沖洗后，再滴加50.0g/L三氯醋酸2ml，使樣品固定，無水乙醇2ml流洗脫色后，置于80烘箱內(nèi)干燥30min。將烘干的濾膜放入盛有5ml閃爍液的測量杯中，置于液體閃爍儀中測Cpm值。每份樣品設(shè)三個(gè)復(fù)孔3,6。結(jié)果見表2。表2結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的小鼠淋巴細(xì)胞與ConA共同培養(yǎng)48h后，與造模對照組比較，藥物組和藥物組均能明

8、顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性（P0.01）。百事通 23  IL2活性測定試驗(yàn)  取1×106個(gè)/ml濃度的小鼠脾細(xì)胞懸液100l于96孔培養(yǎng)板中，加入10.0g/ml ConA，每孔終體積為200l。取上清凍存于-20。參照小鼠IL2 ELISA試劑盒，測定OD450值2,5。結(jié)果見表3。表2  淫羊藿對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響略表3結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的小鼠淋巴細(xì)胞在ConA刺激下產(chǎn)生IL2的能力，與造模對照組比較，藥物I組、藥物組和藥物組均能明顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL2的能力（P0.01）。24  流式細(xì)胞術(shù)測定

9、試驗(yàn) 取1×107個(gè)/ml濃度的小鼠脾細(xì)胞懸液100l于小離心管中，分別加入FTTC標(biāo)記的CD3，PE標(biāo)記的CD4 、CD8抗體10l，振蕩混勻，室溫下避光放置30min，用PBS洗滌2次，再加500l PBS混勻，10min后用流式細(xì)胞儀檢測CD3 、CD4 、CD8 、CD4 /CD8的陽性表達(dá)率5。結(jié)果見表4。表4  淫羊藿對T淋巴細(xì)胞亞群的影響略    表4結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿處理后，能促進(jìn) 60CO 射線照射小鼠CD4/CD8 T淋巴細(xì)胞的恢復(fù)，增加CD4/CD8 T淋巴細(xì)胞比值。藥物處理各組與造模對照組比較，P0.01。3

10、60; 討論NK細(xì)胞屬于非特異性免疫細(xì)胞，它們無需抗原預(yù)先致敏，就可直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染靶細(xì)胞，在機(jī)體抗腫瘤和早期抗病毒和胞內(nèi)寄生菌感染的免疫過程中起重要作用。在腫瘤或病毒特異性IgG抗體存在條件下，NK細(xì)胞還可通過表面IgGFCR介導(dǎo)，識別殺傷與IgG抗體特異性結(jié)合的腫瘤細(xì)胞或病毒感染的靶細(xì)胞。此外，NK細(xì)胞活化后，還可通過分泌IFN、IL2和TNF等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此，NK細(xì)胞具有抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等功能。表1結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共同培養(yǎng)6h后，藥物組和藥物組與造模對照組比較，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性均明顯增強(qiáng)。T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)有多種能

11、結(jié)合絲裂原的膜分子，其結(jié)合絲裂原的特異性由糖基特點(diǎn)決定。與相應(yīng)絲裂原結(jié)合后，可直接誘導(dǎo)靜息T淋巴細(xì)胞活化、增殖和分化。表2結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的小鼠淋巴細(xì)胞與ConA共同培養(yǎng)48h后，與造模對照組比較，藥物組和藥物組均能明顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性。IL2主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可作用于多種免疫效應(yīng)細(xì)胞，包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等，并能誘導(dǎo)產(chǎn)生新型的殺傷細(xì)胞，如淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）。現(xiàn)已證明，T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞表面均表達(dá)IL2R，IL2可與其表面的IL2R結(jié)合而對這些細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。表3結(jié)果顯示，不同濃度淫

12、羊藿處理后的小鼠淋巴細(xì)胞在ConA刺激下產(chǎn)生IL2的能力，與造模對照組比較，藥物I組、藥物組和藥物組均能明顯增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性。特異性細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要是Th1型的CD+4細(xì)胞和CD+8CTL細(xì)胞。前者經(jīng)活化M而誘生炎癥性遲發(fā)型超敏反應(yīng)，在宿主抗胞內(nèi)病原感染中起重要作用；后者通過分泌細(xì)胞毒素及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以帶病原的靶細(xì)胞。表4結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿處理后，能促進(jìn) 60CO 射線照射小鼠CD4/CD8 T淋巴細(xì)胞的恢復(fù)，增加CD4/CD8 T淋巴細(xì)胞比值，藥物處理各組與造模對照組比較。本研究結(jié)果從通過檢測小鼠NK細(xì)胞殺傷活性、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性及IL2分泌活性和CD4/CD8

13、 T淋巴細(xì)胞比值等證明了淫羊藿對小鼠免疫功能有增強(qiáng)作用和對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，對開發(fā)利用淫羊藿這一天然藥物具有實(shí)際意義。參  考  文  獻(xiàn)1  陳國聯(lián)，任茜，李強(qiáng)，等.16種藥用忍冬的抗菌作用實(shí)驗(yàn)研究. 武漢冶醫(yī)學(xué)報(bào),1991,27（1）：14.2  熊平源，郭明雄，張文仁，等. 三普蟲草精對小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究. 武漢冶金科技大學(xué)學(xué)報(bào),1999,22（1）：9295.3  劉小雨，沈自尹，王奇,等. EF對老齡大鼠Th1、Th2、Th3細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用. 中國免疫學(xué)雜志,2005,21（11）：842845.4  Kumagai K，Itoh K，Suzuki R， et al.Studies of murine large granular lymphocytes 1,identificati