人醛糖還原酶基因真核細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建及中草藥醛糖還原酶抑制劑篩選

1、老年醫(yī)學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 人醛糖還原酶基因真核細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建及中草藥醛糖還原酶抑制劑篩選關(guān)鍵詞：醛糖還原酶基因 真核細(xì)胞 中草藥醛糖還原酶抑制劑摘要：糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhib

2、itor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞

3、)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中A

4、R的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His

5、標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模

6、型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。正文內(nèi)容 糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，

7、AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenflu

8、orescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：G

9、FP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR

10、基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定

11、基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)

12、激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)

13、用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白

14、表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察A

15、R和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷

16、、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小

17、的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制

18、劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵

19、母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒p

20、HAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞

21、蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccompli

22、cation，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具

23、有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵

24、母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR

25、，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑

26、制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥AR

27、I篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的A

28、RI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的

29、初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋

30、白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat

31、分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，

32、初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代

33、謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：

34、GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性

35、較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋

36、白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立

37、AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明

38、：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基

39、因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示A

40、R酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于

41、GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因

42、的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，

43、醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將

44、基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Wester

45、nblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，

46、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARIS

47、orbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多

48、元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的預(yù)防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產(chǎn)物，無(wú)明顯不良反應(yīng)，并可經(jīng)過(guò)辨證施治，正確組方研制復(fù)方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴(kuò)血管等多種功能

49、并存，因而在預(yù)防治療DCC方面顯示了良好的應(yīng)用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導(dǎo)入真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)，構(gòu)建AR表達(dá)的蛋白分子模型和AR：GFP的細(xì)胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應(yīng)用該模型進(jìn)行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個(gè)部分： (1)AR基因酵母細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將含人AR基因的酵母重組質(zhì)粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構(gòu)建并保存)，轉(zhuǎn)化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌

50、株。加入CuSO4(記為0hr)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，通過(guò)Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測(cè)AR、AR：GFP的基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及AR酶活性。結(jié)果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細(xì)胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達(dá)較好，AR活性較強(qiáng)(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測(cè)到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達(dá)，但融合蛋白AR：GFP幾乎無(wú)AR活性。 (2)AR基因HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAR、pHAG，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)

51、Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酵母細(xì)胞部分基本一致。結(jié)果顯示AR基因的HEK293細(xì)胞蛋白分子模型成功構(gòu)建，基于GFP探針的AR：GFP細(xì)胞模型不太理想。并借助His標(biāo)簽應(yīng)用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經(jīng)典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對(duì)上述兩個(gè)蛋白分子模型表達(dá)的細(xì)胞總蛋白AR活性進(jìn)行抑制觀察，兩藥物的抑制結(jié)果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關(guān)系，但對(duì)HEK293細(xì)胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細(xì)胞蛋白分子模型進(jìn)行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具

52、有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經(jīng)典的ARISorbinil基本相當(dāng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)AR靶點(diǎn)，成功地構(gòu)建了AR基因的真核細(xì)胞(酵母細(xì)胞/HEK293細(xì)胞)蛋白分子表達(dá)模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細(xì)胞模型有待于進(jìn)一步改進(jìn)。將蛋白分子模型應(yīng)用于中草藥ARI的簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點(diǎn)明確，在中藥ARI篩選方面可以發(fā)揮積極的作用。糖尿病慢性并發(fā)癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個(gè)慢性病變過(guò)程，需要長(zhǎng)期用藥，因而選擇療效確切、靶點(diǎn)清楚、副作用小的藥物來(lái)干預(yù)DCC的發(fā)展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認(rèn)為是DCC的主要發(fā)病機(jī)制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預(yù)防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經(jīng)病變。多數(shù)前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對(duì)DCC的