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文檔簡介

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上巢式PCR：是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。巢式PCR通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的DNA片斷。第二對引物的功能是特異性的擴增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片斷。 第一輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物

2、，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進行第二輪擴增。從而提高反應的特異性。 巢式PCR反應模式圖：巢式PCR的實驗步驟：第一步：目標的DNA模板藍色的第一對引物結(jié)合。第一對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點的片段上并擴增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。 第二步：使用圖中紅色標記的第二套引物對第一輪PCR擴增的產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增。 由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。如果用普通PCR檢測

3、不到條帶是因為擴增模板量太低造成的，為了提高檢測靈敏度和特異性，可以采用巢式PCR。其優(yōu)點是：1、克服了單次擴增“平臺期效應”的限制，使擴增倍數(shù)提高，從而極大的提高了PCR的敏感性；2、由于模板和引物的改變，降低了非特異性反應連續(xù)放大進行的可能性，保證了反應的特異性；3、內(nèi)側(cè)引物擴增的模板是外側(cè)引物擴增的產(chǎn)物，第二階段反應能否進行，也是對第一階段反應正確性的鑒定，因引可以保證整個反應的準確性及可行性。但其亦有缺點：進行第二次PCR墳增引起交叉污染的幾率大。為了克服此缺點，可彩用同一反應管中巢式PCR，主要利用內(nèi)外引物Tm值不同。如果你已排除引物，酶，RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄等等其他原因引起的PCR不成功，確定關鍵原因是模

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