單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測小鼠成纖維細(xì)胞DNA的氧化損傷及修復(fù)

1、單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測小鼠成纖維細(xì)胞DNA的氧化損傷及修復(fù) 【關(guān)鍵詞】 單細(xì)胞凝膠電泳；DNA單鏈斷裂；DNA氧化損傷；DNA修復(fù)摘要：目的 觀察小鼠成纖維細(xì)胞由過氧化氫(H2O2)引起的DNA損傷及其修復(fù)，并詳細(xì)介紹單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)。方法 培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，H2O2造成細(xì)胞氧化損傷，單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE，Comet Assay)檢測細(xì)胞DNA的損傷情況。結(jié)果 建立了H2O2致NIH3T3細(xì)胞DNA損傷的分級圖譜；H2O2引起的小鼠成纖維細(xì)胞DNA單鏈斷裂與H2O2的濃度呈依賴性關(guān)系；細(xì)胞在除去H2O2后15min已出現(xiàn)明顯修復(fù)，多數(shù)修復(fù)可在1h內(nèi)完成，但少數(shù)修復(fù)可能需要較長時間

2、才能完成。結(jié)論 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)是一種簡便、敏感的檢測DNA氧化損傷的方法。關(guān)鍵詞：單細(xì)胞凝膠電泳；DNA單鏈斷裂；DNA氧化損傷；DNA修復(fù)Oxidantinduced DNA damage and the reparationin NIH3T3 mouse fibroblasts by single cell gel electrophoresisABSTRACT: Objective To study H2O2induced single strand breaks(SSB) formation in DNA and the reparation in NIH3T3 mouse fib

3、roblasts by single cell gel electrophoresis technique (SCGE, Comet Assay) and to introduce SCGE. Methods The NIH3T3 mouse fibroblasts were incubated, and cell damage was induced by H2O2 and determined by SCGE. Results H2O2induced damage class graph of the DNA Comet in the NIH3T3 mouse fibroblasts wa

4、s established. H2O2induced SSB was H2O2 dosedependent. The reparation of the damaged DNA was timedependent and could be achieved 15min after incubation. The data indicated that most reparations were completed within 1 hour, but a few might take longer time. Conclusion Single cell gel electrophoresis

5、 technique is a simple and sensitive method to determine oxidationinduced single strand breaks(SSB) formation in DNA.KEY WORDS:single cell gel electrophoresis technique(SCGE); single strand breaks(SSB); oxidantinduced DNA damage; DNA reparation許多資料顯示染色體的誘變、腫瘤的形成以及衰老都與DNA損傷相關(guān)聯(lián)1。觀察藥物對DNA氧化損傷及修復(fù)的影響，對全面

6、闡述藥物抗氧化作用以及探討藥物的作用機理具有重要意義。目前檢測DNA損傷的方法主要有：用高效液相色譜法檢測細(xì)胞、組織或尿液等體液中DNA堿基修飾的代謝產(chǎn)物8羥基鳥嘌呤；用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE, Comet Assay)檢測細(xì)胞的DNA損傷34。作者在日本研修期間用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)在小鼠成纖維細(xì)胞上觀察了由H2O2引起的DNA的損傷及其氧化損傷后DNA的修復(fù)，現(xiàn)將這種方法及實驗結(jié)果介紹如下。1 材料與方法1.1 藥品試劑 細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì) DMEM和小牛血清(FBS)購自Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)平皿為Coring公司產(chǎn)品；Comet Assay試劑盒購自Trevigen公司。1.2 細(xì)胞培

7、養(yǎng)及H2O2損傷方法 DMEM培養(yǎng)液中加入10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素各100u/mL。 NIH小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)用該培養(yǎng)液調(diào)整至3.3104個細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于直徑35mm的培養(yǎng)皿(3mL/皿)，于37、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。置換成不含小牛血清的DMEM，在培養(yǎng)皿中加入H2O2使終濃度分別為0.3-0.5mmol/L，培養(yǎng)15min。再次置換成新鮮的含10%(體積分?jǐn)?shù))小牛血清的DMEM，分別于H2O2處理后即刻、15、30、60、120min收集細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳分析。1.3 單細(xì)胞凝膠電泳(Comet As

8、say) 本方法的原理是先將細(xì)胞固定在葡聚糖凝膠中，用堿(0.3mol/L NaOH)將DNA變性，然后使DNA裂解所形成的片段在電場中遷移，沒有受損傷的DNA，因分子較大遷移較慢保留在原來核的位置，而受損傷的DNA則被裂解成較小的片段而發(fā)生明顯的遷移，DNA被熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察，可見裂解的DNA片段形成象彗星一樣的長尾，根據(jù)“彗尾”的形狀、亮度、尾長評價DNA的損傷。收集的細(xì)胞與10g/L低熔點葡聚糖凝膠(保溫在40，pH 10，PBS溶解)混合。將此細(xì)胞懸液鋪敷于預(yù)先已鋪設(shè)了一層1g/L葡聚糖凝膠的玻片上，玻片在4放置10min后，被置于溶胞液中2.5mol/L NaCl、100

9、mmol/L EDTA、10mmol/L Tris、1%(體積分?jǐn)?shù))TritonX100，pH= 104，60min。然后水平地置于裂解液中(0.3mol/L NaOH、1mmol/L EDTA，pH13)4，20-40min，TBE緩沖液洗兩次，每次5min。于TBE緩沖液中電泳10min(1V/cm)，乙醇脫水，自然干燥，滴加SYBR Green于凝膠層上，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形成的DNA彗尾。1.4 DNA彗尾級別的記錄 根據(jù)DNA損傷后形成的熒光彗尾的形狀、頭的亮度及尾的長度將其分為5個級別，以表示DNA損傷的程度。根據(jù)預(yù)先制成的標(biāo)準(zhǔn)圖譜(圖1)，每個樣品記錄100個細(xì)胞的DNA彗尾

10、的級別填入表1，并計算樣品各級分布的百分頻率和AU(arbitrary units)。AU的計算：DNA彗尾級別從0-4級分別被規(guī)定其AU為0、100、200、300、400，每個樣品的AU=各級分布頻率各級單位數(shù)。 表1 Comet Assay樣品DNA彗星的級別百分頻率分布表和AU單位（略）Table 1 The frequency percentage of DNA Comet on the class and arbitrary units on the sample舉例：樣品1 AU=60%0+30%100+10%200=50(AU)樣品2 AU=20%100+60%200+10%3

11、00+10%400=210(AU)1Visioli F, Grande S, Bogani P, et al. The role of antioxidants in the Mediterranean diets: focus on cancer J. Eur J Cancer Prev, 2004,13(4):337343.蔡凌霜,曾昭睿,吳采櫻. DNA氧化損傷產(chǎn)物及其檢測方法 J. 分析測試學(xué)報, 2001, 20(5):8893.Mihalis P, Orestes T, Dimitrios G. Glucose oxidaseproduced H2O2 induces Ca2+dependent DNA damage in human peripheral blood lymphocytes J. Free Radical