暑假中學骨干生物教師培訓基因工程和細胞工程

1、暑假中學骨干生物教師培訓基因工程和細胞工程 生物材料生物材料DNAmRNA一定大小范圍一定大小范圍DNAPCRcDNA（互補（互補DNA）反轉錄基因組文庫基因組文庫 cDNA文庫文庫 基因文庫基因文庫包括人工合成人工合成限制酶切割獲取目的基因獲取目的基因構建表達載體構建表達載體導入受體細胞導入受體細胞得到轉基因生物得到轉基因生物目的基因檢測與鑒定目的基因檢測與鑒定第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序獲取目的基因獲取目的基因生物材料生物材料PCRcDNAmRNADNA基因組文庫基因組文庫cDNA文庫文庫一定大小范圍一定大小范圍DNA人工合成

2、人工合成逆轉錄逆轉錄限制酶切割限制酶切割獲取目的基因獲取目的基因構建表達載體構建表達載體導入受體細胞導入受體細胞得到轉基因生物得到轉基因生物目的基因檢測與鑒定目的基因檢測與鑒定基因文庫基因文庫(gene library)(gene library)概念概念u又稱又稱DNA文庫，是指某個生物的文庫，是指某個生物的基因組基因組DNA或或cDNA片段片段與與適當的載體適當的載體在體外重組后，轉在體外重組后，轉化化宿主細胞宿主細胞，通過篩選后得到大量的陽性菌，通過篩選后得到大量的陽性菌落落(或噬菌體或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。該生物的基因文庫。u

3、基因文庫由外源基因文庫由外源DNA片段片段、載體載體和和宿主細胞宿主細胞組成。組成。mRNA 結構圖結構圖DNA 結構圖結構圖 基因組文庫(Genomic library)將某種生物體的全部基因組將某種生物體的全部基因組DNADNA用限制性內用限制性內切酶或機械力量切割成一定長度范圍的切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNADNA片段，再與合適的片段，再與合適的載體載體在體外重組并轉化相在體外重組并轉化相應的應的宿主細胞宿主細胞獲得的所有陽性菌落。獲得的所有陽性菌落。該文庫該文庫以以DNA片段的形式貯存著該生物全部基因組片段的形式貯存著該生物全部基因組的信息，可用于的信息，可用于分離目的基因和

4、保存某種生分離目的基因和保存某種生物的全部基因。物的全部基因?；蚪M文庫基因組文庫cDNA文庫 (cDNA library) 提取某生物組織或發(fā)育時期的總提取某生物組織或發(fā)育時期的總mRNAmRNA，經反轉，經反轉錄產生的錄產生的cDNAcDNA片段分別與克隆片段分別與克隆載體載體重組，儲存重組，儲存于于受體菌受體菌中，該群體就稱該生物基因組的中，該群體就稱該生物基因組的cDNAcDNA文庫。文庫。cDNA(complementary DNAcDNA(complementary DNA，互補，互補DNA)DNA)：是由生：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內的物的某一特定器官或特定發(fā)育時

5、期細胞內的mRNAmRNA經體外反轉錄后形成的互補經體外反轉錄后形成的互補DNADNA。結構基因結構基因外顯子外顯子內含子內含子轉錄、加工修飾轉錄、加工修飾mRNA反轉錄酶反轉錄酶cDNA 構建基因文庫的基本程序構建基因文庫的基本程序1)提取研究對象基因組提取研究對象基因組DNA，制備合適大小的，制備合適大小的DNA片段，片段，或提取組織或器官的或提取組織或器官的mRNA并反轉錄成并反轉錄成cDNA；2) DNA片段或片段或cDNA片段與經特殊處理的片段與經特殊處理的載體載體連接形成連接形成重組重組DNA；3)重組重組DNA轉化轉化宿主細胞宿主細胞或體外包裝后侵染受體菌；或體外包裝后侵染受體菌

6、；4)陽性重組菌落或噬菌斑的篩選。陽性重組菌落或噬菌斑的篩選。基因組基因組DNADNA文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫基因組文庫的類型基因組文庫的類型根據所選用的載體可以分為：根據所選用的載體可以分為： 質粒文庫、噬菌體文庫、人工染色體文庫（細質粒文庫、噬菌體文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）?；蚪M文庫的質量標準基因組文庫的質量標準一個理想的基因組文庫應具備下列條件：一個理想的基因組文庫應具備下列條件：u重組克隆的總數不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；重組克隆的總數不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；u載體的裝載量最好大于基因的長

7、度，避免基因被分隔克隆；載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克??；u克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序；排序；u克隆片段易于從載體分子上完整卸下；克隆片段易于從載體分子上完整卸下；u重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選。cDNAcDNA文庫的主要優(yōu)點文庫的主要優(yōu)點cDNAcDNA文庫特別適用于某些文庫特別適用于某些RNARNA病毒的基因組結病毒的基因組結構研究及有關基因的克隆分離；構研究及有關基因的克隆分離；cDNAcDNA文庫較小，易于篩選；文庫較小，易于篩選；cDNAcDNA文庫可

8、用于在細菌中表達真核生物的基因；文庫可用于在細菌中表達真核生物的基因；cDNAcDNA文庫結合基因組文庫可用于真核細胞文庫結合基因組文庫可用于真核細胞mRNAmRNA的結構和功能研究。的結構和功能研究。cDNAcDNA克隆的主要的缺點克隆的主要的缺點cDNAcDNA文庫所包含的遺傳信息遠少于基因組文庫所包含的遺傳信息遠少于基因組DNADNA文庫，并且受細胞來源或發(fā)育時期的影響；文庫，并且受細胞來源或發(fā)育時期的影響；cDNAcDNA文庫不能直接獲得基因內含子序列和基文庫不能直接獲得基因內含子序列和基因編碼區(qū)外大量調控序列的結構與功能方面因編碼區(qū)外大量調控序列的結構與功能方面信息；信息；在在cDN

9、AcDNA文庫中，高豐度文庫中，高豐度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆所占克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而低豐的比例比較高，分離起來比較容易，而低豐度度mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆所占的比例則比較低，因克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。此分離也就比較困難。 從基因文庫中篩選目的基因1.1.通過克隆序列篩選：核酸雜交通過克隆序列篩選：核酸雜交( (探針）和探針）和PCRPCR（引物）（引物）2.2.通過表達產物篩選：免疫學檢測（抗原抗體反通過表達產物篩選：免疫學檢測（抗原抗體反應）應）探針探針探針是一小段帶標記的單鏈DNA或者RNA片段（大約是20到50

10、0bp）， 用于檢測與其互補的核酸序列。 最初是使用帶放射性的DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核苷酸的側鏈加以改造，探針雜交后，其側鏈可被帶有熒光標記的抗體所識別，從而顯示出位置。菌落原位雜交法（核酸雜交）菌落原位雜交法（核酸雜交）直接把菌落印跡轉移到硝酸纖維素濾膜上直接把菌落印跡轉移到硝酸纖維素濾膜上, ,經溶菌和變性處理后使經溶菌和變性處理后使DNADNA暴露出來并與濾暴露出來并與濾膜原位結合膜原位結合, ,再與特異性再與特異性DNADNA探針雜交探針雜交, ,篩選篩選出含有目的序列的菌落。出含有目的序列的菌落。對應的菌斑或噬菌斑位置不變，對應的菌斑或噬

11、菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落?？梢灾苯诱页鲫栃跃?。特點：特點：PCR篩選法 利用合適的引物，以從初選出來的陽性利用合適的引物，以從初選出來的陽性克隆中提出的質粒為模板進行克隆中提出的質粒為模板進行PCR，通過對，通過對PCR產物的電泳分析，確定目的基因序列所產物的電泳分析，確定目的基因序列所在克隆。在克隆。免疫篩選法免疫篩選法放射性抗體檢測法放射性抗體檢測法濾膜（固定抗體）濾膜（固定抗體）+免疫沉淀檢測法免疫沉淀檢測法菌落菌落沉淀素沉淀素高等生物的基因組高等生物的基因組DNADNA十分復雜十分復雜, ,單個基因在基因單個基因在基因組或某個特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很組或某個特定發(fā)

12、育階段或特定組織中所占比例很小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個特定小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個特定的的未知基因未知基因非常困難，因此非常困難，因此先把材料先把材料DNA分成分成若干易于處理的片段，然后確定目標序列在哪一若干易于處理的片段，然后確定目標序列在哪一片段，再進一步從該片段尋找目標序列，事情就片段，再進一步從該片段尋找目標序列，事情就變得容易了。變得容易了。為什么要建為什么要建基因文庫？基因文庫？PCRPCR法獲取目的基因法獲取目的基因已知基因：已知基因：設計合成一對引物，直接從基因組DNA（或文庫）中擴增該目的基因。未知基因：未知基因：參照其他物種中該基因的兩末端設計引

13、物，從基因組DNA（或文庫）中擴增該目的基因；依照其他物種中該基因的保守區(qū)段序列設計引物，擴增出一段DNA，標記為探針，從基因組文庫、cDNA文庫中釣出該基因。PCRPCR法獲取目的基因的法獲取目的基因的前提是：前提是：要有足夠制備要有足夠制備合適引物的信息合適引物的信息PCRPCR法獲取目的基因優(yōu)點法獲取目的基因優(yōu)點1.簡便快速：在有足夠引物信息的情況下，可直接從基因組DNA中克隆目的基因，大大減少了基因分離的工作量；2.靈敏度高：可從極微量的模板擴增出目的片段；3.對起始材料質量要求低：由于其靈敏度高和特異性強，極微量的材料或者混合的組織、部分已降解的DNA材料都可以作為起始材料；4.也可

14、用于基因文庫的構建。化學合成制備目的基因磷酸二酯法亞磷酸三酯法獲取目的基因的方法一般來說：一般來說： 目的基因的獲得通常采用PCR法；化學合成法由于合成的片段較短，一般用于引物和探針的合成；基因文庫一般用于保存基因資源。目的基因檢測與鑒定通常采用通常采用分子雜交分子雜交的方法。的方法。分子雜交：采用已知標記的核酸分子或蛋白質分分子雜交：采用已知標記的核酸分子或蛋白質分子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質分子。子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質分子。根據其檢測對象的不同可分為根據其檢測對象的不同可分為 Southern 雜交雜交（DNA）、）、Northern 雜交（雜交（RNA）和）和 We

15、stern 雜交雜交 （蛋白質）。 分子雜交可在分子雜交可在DNADNA與與DNADNA、RNARNA與與RNARNA或或RNARNA與與DNADNA的二條單鏈之間進行，也可以在蛋白質的二條單鏈之間進行，也可以在蛋白質與蛋白質之間進行。與蛋白質之間進行。 核酸分子雜交是指核酸分子核酸分子雜交是指核酸分子(DNA(DNA或或RNA)RNA)在變在變性以后，在復性的過程中兩個不同來源的且性以后，在復性的過程中兩個不同來源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。蛋白質之間的雜交通過抗原抗體反應進行。蛋白質之間的雜交通過抗原抗體反應進行。通常通過各種方法將核酸（蛋白質）

16、分子固通常通過各種方法將核酸（蛋白質）分子固定在固相支持物上，然后用放射性元素等標定在固相支持物上，然后用放射性元素等標記的探針（抗體）與被固定的分子雜交，經記的探針（抗體）與被固定的分子雜交，經顯影（顯色）后顯示出目的核酸（蛋白質）顯影（顯色）后顯示出目的核酸（蛋白質）分子。分子。 Southern雜交的操作步驟(1) 酶切酶切DNA，凝膠電泳分離各酶切片段，凝膠電泳分離各酶切片段,然后使然后使DNA原原位變性。位變性。 (2) 將將DNA片段轉移到固體支持物片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼硝酸纖維素濾膜或尼龍膜龍膜)上。上。 (3) 預雜交濾膜預雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。掩

17、蓋濾膜上非特異性位點。(4) 讓探針與同源讓探針與同源DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異片段雜交，然后漂洗除去非特異性結合的探針。性結合的探針。 (5) 通過顯影檢查目的通過顯影檢查目的DNA所在的位置。所在的位置。 放射自顯影放射自顯影DNA印跡轉移印跡轉移探針雜交探針雜交 Northern雜交NorthernNorthern雜交的過程雜交的過程 提取總提取總RNA 分離分離mRNA，利用親和層析的原理純化利用親和層析的原理純化mRNAmRNA。 制備制備RNA探針，探針，根據根據mRNAmRNA序列合成同源序列合成同源DNADNA探針，探針，或以或以cDNAcDNA為探針。為探針。 Nor

18、thern雜交，雜交，通過顯影檢查目的通過顯影檢查目的DNA所在的位所在的位置。置。 Southern雜交和雜交和Northern雜交過程示意圖雜交過程示意圖 Western雜交中文一般稱為蛋白質印跡技術。其基本原理是通過特異性抗體特異性抗體對凝膠電泳分離的細胞或生物組織蛋白樣品進行檢測。Western Blot與Southern雜交或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。 Western雜交過程經過SDS-PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素膜）上，以固相載體上的蛋白質或

19、多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的目的蛋白。根據檢測結果，從而可得知被檢細胞內目的蛋白表達與否、表達量及分子量等情況。 第一步 抗體識別抗原第二步 第二抗體識別第一抗體第三步 顏色反應Western雜交結果圖建立文庫需要重組子的數目 N=ln(1-P)/ln(1-1/n)N：重組子數目；P：文庫中包括任意DNA片段的概率；n：總基因組堿基數/克隆片段堿基數。例：假如重組片段大小為20kb，要使文庫包含該基因組任一片段的概率達到99%，則N大腸桿菌=ln(1-0.99)/ln(1-1/4.6/20103)=1.110

20、3N人=ln(1-0.99)/ln(1-1/2.8/20106)=6.5105常見載體容量載體質粒噬菌體黏粒細菌人工染色體（BAC）酵母人工染色體（YAC）容量（kb)1023453501000（二）細胞工程細胞融合與單克隆抗體細胞融合與單克隆抗體細胞融合（細胞融合（cell fusion)，又稱體細胞雜交（somatic hybridiazation），是指兩個或更多個相同或不同細胞通過膜融合，形成單個細胞的過程。細胞融合的意義細胞融合的意義u理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。u繞開了種間生殖隔離的限制，為遠緣物種間的遺傳物

21、質交換提供了有效途徑。u體細胞雜交產生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產生新的核外遺傳系統(tǒng)。u淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。顯微鏡下細胞融合過程顯微鏡下細胞融合過程細胞融合的常用方法細胞融合的常用方法一、滅活病毒法一、滅活病毒法兩種細胞在一起培養(yǎng)，加入滅活病毒，在4條件下病毒附著在細胞膜上。并使兩細胞相互凝聚；在37中，病毒與細胞膜發(fā)生反應，細胞膜受到破環(huán)，此時需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP；融合成大細胞，需ATP 。二、聚乙二醇（PEG）法

22、PEGPEG分子式：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作細胞融合劑.PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，鍵，從而在在質膜之間形成分子橋，其結果是使細胞從而在在質膜之間形成分子橋，其結果是使細胞質膜發(fā)生粘連進而促使質膜的融合質膜發(fā)生粘連進而促使質膜的融合.PEG誘導融合的特點誘導融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，其優(yōu)點是融合成本低，不需特殊設備；融合子異核率較高；融合過程不不需特殊設備；融合子異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點

23、是融合過程繁瑣，受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能可能對細胞有毒害。對細胞有毒害。三、電融合法三、電融合法 電融合法是在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：電融合法的優(yōu)點：u融合率高，重復性強，對細胞傷害?。籾裝置精巧，方法簡單，可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；u免去PEG誘導后的洗滌過程，誘導過程可控性強。細胞雜交瘤技術與單克隆抗體細胞雜交瘤技術與單克隆抗體抗體 由抗原刺激由抗原刺激B淋巴細胞產生的，并能與淋巴細胞產生的，并能與刺激其產生的抗原發(fā)生特異性結合的、

24、具有刺激其產生的抗原發(fā)生特異性結合的、具有免疫功能的糖蛋白。免疫功能的糖蛋白。抗原決定簇抗原決定簇抗原分子中存在的能與抗體抗原分子中存在的能與抗體Fab片段特異性片段特異性結合的特殊化學基團，是免疫應答特異性的結合的特殊化學基團，是免疫應答特異性的物質基礎。物質基礎。構象決定簇與線性決定簇單克隆抗體單克隆抗體 定義：定義：由單一克隆B細胞雜交瘤產生的、只識別抗原分子某一特定抗原決定簇的高度特異性的抗體。每種單克隆抗體其分子結構完全相同。多克隆抗體多克隆抗體 定義定義：抗原分子通常具有多個抗原決定簇，動物免疫后可刺激多種具有相應抗原受體的B細胞發(fā)生免疫應答，因而可產生多種針對不同抗原決定簇的抗體

25、。這些由不同B細胞克隆產生的抗體稱為多克隆抗體（polycolonal antibody, PcAb）。 單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞與經特定單克隆抗體技術的核心是用骨髓瘤細胞與經特定抗原免疫刺激的抗原免疫刺激的B淋巴細胞融合得到雜交瘤細胞，雜淋巴細胞融合得到雜交瘤細胞，雜交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，交瘤細胞既能象骨髓瘤細胞那樣在體外無限增殖，又具有又具有B淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此，單淋巴細胞產生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術又稱為雜交瘤技術?？寺】贵w技術又稱為雜交瘤技術。骨髓瘤細胞選擇骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體骨髓瘤細胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤選擇

26、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷型（型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）瘤細胞）瘤細胞在旁路合成途徑中，在旁路合成途徑中，HGPRT負責催化磷酸核負責催化磷酸核糖焦磷酸和嘌呤基形成嘌呤單磷酸核苷酸，糖焦磷酸和嘌呤基形成嘌呤單磷酸核苷酸，而而TK可催化胸苷轉化為可催化胸苷轉化為5-單磷酸胸苷，作為單磷酸胸苷，作為胸苷脫氧核苷酸合成的材料。胸苷脫氧核苷酸合成的材料。HAT選擇培養(yǎng)基含次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培養(yǎng)基，是動物雜交細胞篩選中最常用的方法。在這種培養(yǎng)基中細胞只能利用旁路途徑合成DNA，因而只有具有HGPRT+或/和TK+的細胞才能生長。細胞內DNA的合成