2020年生物科技行業(yè)CLSI臨床微生物試驗室標準解讀

1、（生物科技行業(yè)）CLSI臨床微生物實驗室標準解讀20XX年XX月多年的企業(yè)咨詢豉問經(jīng)驗.經(jīng)過實戰(zhàn)驗證可以落地機行的卓越管理方案，值得您下載擁有CLSI臨床微生物實驗室標準解讀CLSI2010更新CLSI臨床微生物實驗室標準解讀第三輯2010年CLSI藥敏試驗的更新中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院楊啟文王輝美國臨床和實驗室標準化研究所（TheClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）是壹個國際性、跨學科、非營利的、致力于發(fā)展操作標準的教育組織。其抗菌藥物敏感性試驗小組委員會（SubcommitteeonAntimicrobialSusceptibili

2、tytesting）每年組織該領域專家和藥廠代表等對藥敏相關文件M100進行壹次修訂。目前我國的臨床微生物實驗室均以CLSI文件作為藥敏指導文件進行試驗操作和報告，本文將CLSIM100-S20（2010年）的主要更新點總結如下：壹、主要格式的更新：下表顯示了壹些在M100-S19（2009年）中位于最后的附錄在M100-S20（2010年）文件中新的命名、編號和位置。表1.M100-S20的格式更新二、表1和表2介紹內容中的更新M100-S19中的名稱M100-S20名稱/位置附錄A（ESBLs的篩選和確證試驗）補充性表格2A-S1/表2A的最后附錄G（碳富酶烯酶的篩選和確證試驗）補充性表格

3、2A-S2/表2A的最后附錄B（金黃色葡萄球菌的篩選試驗）補充性表格2C-S3/表2c的最后附錄C（凝固酶陰性葡萄球菌的篩選試驗）補充性表格2C-S4/表2c的最后附錄D（腸球菌的篩選試驗）補充性表格2D-S5/表2D的最后附錄E（M敏結果的確證建議）附錄A/M100-S20的最后，術語表前附錄F（藥敏試驗的質控菌株）附錄B/M100-S20的最后，術語表前（1）修訂了“非敏感”的定義：M100-S20中對“非敏感”的定義是由于耐藥菌株缺失或稀少因而僅確立了敏感性解釋標準。當藥物對菌株的MIC高于或抑菌圈直徑低于此折點時需報告為非敏感。非敏感且不意味著菌株攜帶某種耐藥機制。有可能MIC高于敏感

4、折點的菌株缺乏耐藥機制且且屬于野生菌株，只不過其出現(xiàn)于敏感性折點確立后。對于“非敏感”的菌株，菌株鑒定和藥敏結果需被再次確認。（2）對“使用頭抱曝吩的折點僅用于預測對其他頭胞菌素的敏感性”增加注釋：在M100-S20中，頭抱曝吩的折點僅可用于預測菌株對口服藥物，包括抱羥氨節(jié)，頭抱泊腸，頭抱氨節(jié)和氯碳頭胞的敏感性。舊的數(shù)據(jù)認為頭抱曝吩的結果能夠預測某些其他頭抱菌素的敏感性可能仍然正確，但目前的數(shù)據(jù)尚不能支持此論點。在M100-S20的第26頁增加第VII部分來描述篩選試驗且總結他們的局限性以及對應的確證試驗。該部分總結了腸桿菌科菌、金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、腸球菌和肺炎鏈球菌的耐藥表型

5、初篩試驗和對應的確證試驗。（4）在表1和1A的警告框內，M100-S20將頭霉素類藥物加入腦脊液分離菌株中不能常規(guī)報告的抗菌藥物列表中。在M100-S19中，口服抗菌藥物、第壹代和第二代頭胞菌素（除外靜脈用頭抱吠辛）、克林霉素、大環(huán)內酯類、四環(huán)素類和氟唾諾酮類被列為腦脊液分離菌株中不能常規(guī)報告的抗菌藥物，因為這些藥物不是腦脊髓感染的選擇藥物，在M100-S20中，頭霉素類藥物（如頭抱西丁、頭抱美嘎和頭抱替坦）也被納入此類藥物。三、腸桿菌科菌相關的更新（1）修訂了頭抱睡咻、頭抱曝腸、頭抱他咤、頭抱睡肢、頭抱曲松和氨曲南的折點，且在折點后增加了對應的用藥方案。I修訂折點的原因在CLSI文件M100

6、-S20的第17頁有壹個關于折點如何建立的簡短注釋。本段話參考的是CLSI關于折點發(fā)展的指南性文件：M23-體外藥敏試驗標準和質量控制參數(shù)的發(fā)展。簡單地說，修改折點涉及微生物學、藥理學和臨床數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性回顧。公認的專家，制藥業(yè)贊助商和監(jiān)管機構參和這壹過程，其中包括CLSI藥敏試驗小組委員會每年倆次的在公開會議討論。若為新的藥物建立原始折點，對照的臨床試驗數(shù)據(jù)是必需的。然而在修改折點時，雖然對照臨床試驗是可取的，但在處理快速變化的細菌耐藥機制和“老”的藥物時這些試驗往往且不可行。因此，小組委員會必須依賴于由發(fā)表的文獻資料、專家意見和共識所支持的最佳實踐。流行病學、臨床實踐以及任何折點修訂的監(jiān)管影

7、響必須予以考慮。折點需要修訂是由于不斷變化的耐藥機制和細菌菌群分布，不斷進步的科學增進了人們對臨床反應藥理學因素的認識以及“最佳治療”被臨床醫(yī)生所接受。在臨床實踐中常規(guī)使用的許多藥物折點源于25年前的臨床操作，而這些操作以今天的監(jiān)管和質量保證標準來見是不可接受的。不論在美國和歐洲，不斷評估和更新折點已得到了微生物學家、臨床醫(yī)生和監(jiān)管機構的普遍認同。例如，2007年通過的美國食品和藥物管理法修正案（FDAAA）規(guī)定FDA更新折點，且且美國FDA已經(jīng)在2009年作出回應，為行業(yè)印發(fā)指導文件，以在系統(tǒng)性抗菌藥物產(chǎn)品和藥敏試驗設備中更新藥敏試驗信息標記。M100-S20修訂后的折點能更好地反映抗菌藥物

8、在以目前推薦方案治療由菌株引起的感染時的真實療效。對產(chǎn)ESBL菌株的研究結果發(fā)揮了重大作用。最初CLSI推薦進行ESBLs篩選及確證測試，且規(guī)定對于產(chǎn)ESBL的菌株，將青霉素，頭抱菌素和氨曲南的藥敏結果由敏感改為耐藥，這條規(guī)定基于以下幾點：1）研究觀察到某些產(chǎn)ESBL菌株，之上藥物的MIC有升高但仍然在敏感區(qū)間（使用舊的折點）；2）有限的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，對于產(chǎn)ESBL菌株引起的感染，病人預后較差。ESBL試驗建議是處理壹個新型耐藥機制的短期解決方案。隨后，更多的耐藥機制被發(fā)現(xiàn)（例如，新型的ESBLs和AmpC酶），且且越來越多的菌株被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)多種酶導致ESBL的檢測更加復雜。之上事實以及人們對頭抱

9、菌素類和單環(huán)B內酰胺類的PK-PD因素對治療效果決定作用的認識導致折點的變更。折點修訂后，ESBLs篩選和確證試驗將不再是決定治療策略所必需。當菌株產(chǎn)多種酶時（如當菌株同時產(chǎn)ESBLs和AmpC酶時將導致假陰性的結果）ESBL表型檢測和確證試驗的準確性將降低，而在當前，產(chǎn)多種酶的菌株已非常普遍。菌株的MIC和臨床預后的相關性強于菌株攜帶的耐藥機制。CLSI認為，新的折點將為病人治療提供更合理的信息且降低臨床實驗室工作的不確定度和工作量。n新折點和舊折點的比較對于腸桿菌科菌，頭胞菌素和氨曲南的折點修訂如下（作為比較，也列出舊的折點）:表2.M100-S20MIC折點更新（ug/ml）:抗菌藥物舊

10、(M100-S19)新(M100-S20)敏感中介耐藥敏感中介耐藥頭抱睡咻<816>32<12>4頭抱曝腸<816-32>64<12>4頭抱嘎曲<816-32>64<12>4頭抱曲松<816-32>64<12>4頭抱他呢<816>32<48>16氨曲南<816>32<48>16表3.M100-S20紙片擴散法折點更新（mm）:抗菌藥物舊(M100-S19)新(M100-S20)敏感中介耐藥敏感中介耐藥頭抱睡咻>1815-17V14NANANA頭抱

11、曝腸>2315-224>1623-25V22頭抱嘎曲>2015-19<14>2522-24V21頭抱曲松>2114-20V13>2320-22V19頭抱他呢>1815-17V14>2118-20V17氨曲南>2216-21V15>2118-20V17NA=未確定和頭抱睡咻修訂后MIC折點相關的抑菌圈直徑折點尚未確立。初步的研究且沒有確立明確的抑菌圈直徑折點，且且頭抱嘎咻的紙片擴散法試驗可能需要使用壹種改變含藥劑量的新型紙片。另外，以下藥物對腸桿菌科菌的折點也被重新評估但沒有被修改（這些藥物的紙片擴散法折點也沒有被修改）:表4,M

12、100-S20MIC折點（ug/ml）頭抱西丁折點不修改是因為當前數(shù)據(jù)支持現(xiàn)有的折點。PK-PD評估表明，推薦的藥物劑量在目標范圍內。頭抗菌藥物舊(M100-S19)新(M100-S20)敏感中介耐藥敏感中介耐藥頭抱吠辛（腸外）<816>32<816>32頭抱叱腸<816>32<816>32頭抱替坦V1632>64V1632>64頭抱西丁<816>32<816>32抱替坦的折點未改變是因為沒有足夠的數(shù)據(jù)支持。頭霉素類不被ESBLs水解且且頭霉素的敏感結果不會由于ESBLs的確證試驗陽性而改為耐藥。頭抱叱曲折點沒

13、有修改是基于臨床試驗數(shù)據(jù)和PK-PD評估。臨床試驗證實了對于產(chǎn)ESBL但頭抱叱曲敏感（MIC&8gg/ml）的菌株感染的病人，頭抱叱曲是有療效的。PK-PD評價結果表明，頭抱口的肘日劑量超過3克（即每8小時1克或每12小時2克）能夠使頭抱叱腸的藥物濃度達到評估折點時所使用的目的暴露標準。數(shù)據(jù)回顧顯示，沒有必要修訂現(xiàn)行的頭抱吠辛（注射）折點，但需注意現(xiàn)行折點只適用于每8小時1.5克或更高的給藥劑量。對于壹般不在美國使用或銷售的頭抱菌素，如頭抱孟多，頭抱尼西，頭抱哌酮和拉氧頭抱，其折點沒有重新評估。因此，當測試這些藥物對大腸桿菌、克雷伯菌屬和奇異變形桿菌的抗菌活性時，需要進行ESBLs篩選

14、和確證試驗。X于ESBL確證試驗陽性的菌株，這些藥物的敏感結果均需報告為耐藥。注射用頭抱曝吩不再在美國使用。由于和腸桿菌科相關，口服頭抱曝吩主要用于尿路感染的治療。頭抱曝吩的敏感性結果可代表其他幾種FDA批準用于治療尿路感染的口服藥物的活性，包括頭抱羥氨節(jié)，頭抱泊腸，頭抱氨節(jié)和氯碳頭抱。故M100-S20將頭抱曝吩由檢測/報告A組轉至U組。W使用新折點的報告原則：當使用經(jīng)修訂的折點則沒有必要進行ESBL初篩和確證試驗來報告結果以指導病人治療。決定是否為感染控制或流行病學目的進行ESBLs確證試驗應和傳染病醫(yī)生，藥劑師以及感染控制委員會的醫(yī)務人員進行討論決定。新的折點應和各單位的實驗室報告相關人

15、員共同討論。傳染病醫(yī)生，藥劑師和其他了解抗菌藥物治療的醫(yī)務人員應教導其他醫(yī)生關于折點修訂的情況以及如何用新折點指導藥物使用。重要的是，那些使用藥敏結果指導治療決策的醫(yī)生須知道，新的折點適用于美國FDA批準的給藥方案（如M100-S20表2A所列）。這些反映了來自制藥X公司處方信息或產(chǎn)品標簽的成人標準治療劑量。各醫(yī)療機構的藥物劑量和藥物調整政策需重新評估以保證和CLSI推薦折點相壹致，因為臨床醫(yī)生不太可能要求實驗室的常規(guī)報告上注明給藥方案。W修訂后折點和ESBL的關系不是所有的產(chǎn)ESBLs菌株使用新修訂的折點均檢測為耐藥。修訂后的頭抱菌素和氨曲南折點都關注于MIC和藥代動力學而不是耐藥機制。正如

16、前所示，某些ESBL水解某些頭抱菌素的能力強于其他藥物，從而導致某些藥物（如頭抱曝腸）對產(chǎn)酶菌株的MIC明顯高于其他藥物（如頭抱他咤）。另外，不同菌株的產(chǎn)酶量是有差異的，因此當產(chǎn)酶量多時MIC會升高。當使用經(jīng)修訂的折點則沒有必要進行ESBL初篩和確證試驗來報告結果以指導病人治療。某種耐藥機制能夠導致不同強度的耐藥性，如ESBL對頭抱菌素和氨曲南。這些差異能夠導致不同的MIC。例如，壹些產(chǎn)ESBL菌株用修訂后折點對頭抱他呢敏感但對頭抱曲松耐藥。同樣，另壹個產(chǎn)ESBLs菌株可能對頭抱曲松敏感而對頭抱他呢耐藥。目前建議，這些頭胞菌素的敏感結果在報告時不改為耐藥，因為研究表明，MIC是產(chǎn)酶菌株感染治療

17、預后的最佳指標。V修訂后折點和AmpC的關系和產(chǎn)ESBLs菌株壹樣，且非所有產(chǎn)AmpC酶菌株用修訂后折點將測試為耐藥。這是因為除了克雷伯菌屬和壹些大腸桿菌外，大多數(shù)腸桿菌科細菌均低水平產(chǎn)染色體AmpCB-內酰胺酶，頭抱菌素的MIC較低且處于敏感范圍（使用新折點）。然而，最常見的AmpC酶介導的耐藥是因為產(chǎn)高水平AmpC酶突變株的選擇（“去阻遏突變體”）從而滅活頭抱菌素類繼而導致耐藥。壹個例外是頭抱叱曲，其不容易被AmpC酶滅活。在所有情況下，建議將檢測結果和報告結果壹致。如果菌株高產(chǎn)AmpC酶合且孔通道缺失，也可能對碳青霉烯類、青霉素類和頭胞菌素類均耐藥。目前CLSI不推薦任何檢測腸桿菌科菌中

18、AmpC酶的試驗。壹些AmpC酶的表型檢測試驗已公布但目前這些實驗仍未充分評估，因此尚未被CLSI推薦。正如ESBLs檢測試驗，CLSI不推薦AmpC酶檢測試驗以進行治療決策。決定是否為感染控制或流行病學目的進行AmpC檢測應和傳染病醫(yī)生，藥劑師以及感染控制委員會的醫(yī)務人員進行討論決定。由于沒有檢測產(chǎn)AmpC酶表型的標準化方法，這些方法的局限性，必須傳達給那些使用這些結果的人員。VI修訂后折點在商品化藥敏系統(tǒng)中的應用若滿足以下條件則可在商品化藥敏系統(tǒng)中使用修訂后折點：1）藥敏系統(tǒng)的最低藥物測試濃度需能容納修訂的折點濃度；2）有壹套體系可使用修訂的折點來解釋MIC結果（例如，能夠修改軟件系統(tǒng)中的

19、折點或手工解釋藥敏結果）和3）需進行實驗室內驗證。此策略也在CLSI的M100-S20第18頁指出：“通過和傳染病醫(yī)生和藥房部門以及治療和藥劑業(yè)及感染控制委員會的醫(yī)務人員進行討論，臨床實驗室可推行修訂的折點”。對于紙片擴散法，壹旦CLSI在M100文件中公布了其新的折點，臨床實驗室即可采用。如果藥敏系統(tǒng)包含的抗菌藥物濃度足以使用CLSI折點解釋藥物敏感性，那么，實驗室經(jīng)過適當?shù)尿炞C后即可使用CLSI折點解釋和報告藥敏結果。表5.M100-S20中新增的藥敏質控范圍四、葡萄球菌屬相關的更新（1）澄清對苯隆西林耐藥金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌的結果報告原則：在M100-S20中，對于苯隆西林

20、耐藥金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌（MRS）,6內酰胺類藥物，如青霉素類、6內酰胺/網(wǎng)酰胺酶抑制劑復合藥物、頭抱類（除外新型的有抗MRSA活性的頭抱菌素，如ceftaroline和ceftobiprole）和碳青霉烯類體外可能敏感但臨床無效，因此除了有抗MRSA活性的新型頭抱菌素外，其他B內酰胺類藥物的結果均需報告為耐藥或不報告。（2）修改將金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌寄送至參考實驗室確認的建議：建議將萬古霉素MIC>8ng/m的金黃色葡萄球菌和MIC>32（1g/m的凝固酶陰性葡萄球菌寄送至參考實驗室確認。（3）MRSA菌株的擴展定義：MRSA指表達mecA或其他甲氧西林耐藥機

21、制（如青霉素結合蛋白對苯嘎西林親和力改變，修飾的金葡菌，MOD-SA）的金黃色葡萄球菌。（4）對于對青霉素敏感可是可能產(chǎn)6內酰胺酶的葡萄球菌，6內酰胺酶測試試驗的局限性進行了擴展討論：對于青霉素MICV0.12ug/m£抑菌圈直徑。29mm葡萄球菌需進行誘導性B內酰胺酶試驗。然而，青霉素敏感的金葡菌很少，對青霉素敏感的菌株仍多產(chǎn)誘導性6內酰胺酶。因此對于嚴重感染，實驗室應首先進行青霉素的MIC檢測，而后再進行誘導性6內酰胺酶試驗。（5）澄清了當頭抱西丁和苯嘎西林同時被用于測試金葡菌或路登葡萄球菌，當其中壹個試驗耐藥時的報告建議：當頭抱西丁和苯嘎西林同時被用于測試金葡菌或路登葡萄球菌時

22、，只要其中壹個耐藥，即可報告“苯嘎西林耐藥”(6)增加利奈嘎胺紙片擴散法和MIC法的“耐藥”解釋標準：在M100-S20中，30u利奈嘎胺紙片的紙片擴散法耐藥折點為v20mmMIC法的耐藥折點則為。8ug/ml。(7)進壹步討論耐酶青霉素類的交叉敏感性：假如檢測青霉素酶穩(wěn)定的青霉素類藥物，苯嘎西林是優(yōu)先選擇的抗菌藥物，其結果能夠用于預測其他青霉素酶穩(wěn)定的青霉素類藥物，鄰氯西林，雙氯西林，氟氯西林，甲氧西林和奈夫西林。(8)強調了對于苯隆西林MIC在0.5-2gg/ml的非表皮葡萄球菌的其他凝固酶陰性葡萄球菌中進行附加試驗的建議：苯嘎西林折點可能會高估了壹些凝固酶陰性葡萄球菌的耐藥性，因為壹些非

23、表皮的凝固酶陰性葡萄球菌在苯嘎西林MIC為0.5-2ug/ml時且不攜帶mecA基因(苯嘎西林耐藥折點為。0.5g/ml)。因此，對于WMlC梅0.5-2gg/ml的非表皮葡萄球菌的其他凝固酶陰性葡萄球菌引起的嚴重感染，推薦檢測mecA或PBP2a或采用頭抱西丁紙片擴散法。五、其他菌種相關的更新對于銅綠假單胞菌，M100-S20刪除壹條建議：“在治療銅綠假單胞菌感染時推薦聯(lián)用另壹種抗菌藥物(如氟唾諾酮類藥物或氨基糖昔類藥物)”。對于不動桿菌屬：將黏菌素和多粘菌素從實驗報告C組中刪除。對于腸球菌，修改進行6內酰胺酶試驗的建議：由產(chǎn)6內酰胺酶導致的腸球菌耐青霉素和氨節(jié)西林非常罕見，因此腸球菌的6內

24、酰胺酶不必常規(guī)檢測。對于6溶血鏈球菌，修改有關青霉素和其他6內酰胺類藥物的交叉敏感性的評論：對于A、B、C、G群6溶血鏈球菌，若青霉素敏感，可認為菌株對氨節(jié)西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉維酸、氨節(jié)西林-舒巴坦、頭抱嘎咻、頭抱叱腸、頭抱拉定、頭抱曝吩、頭抱曝腸、頭抱曲松、頭抱嘎腸、亞胺培南、厄他培南和美羅培南敏感。另外對于A群鏈球菌，青霉素敏感可認為對頭抱克羅、頭抱地尼、頭抱丙烯、頭抱布坦、頭抱吠辛、頭抱泊腸和頭抱匹林敏感。對于草綠色鏈球菌，刪除以下建議：“若菌株對青霉素敏感則可認為對其他6內酰胺類藥物敏感”。且澄清表2H-2中所涵蓋的菌株：草綠色鏈球菌包括以下5個菌群，每個菌群包含幾個菌屬：可

25、變鏈球菌群、唾液鏈球菌群、牛鏈球菌群、咽峽炎鏈球菌群(以往的米勒鏈球菌群)和mitis鏈球菌群。咽峽炎鏈球菌群包括小菌落A、C、F、G群B溶血鏈球菌。對于腦膜炎奈瑟氏菌，在頭抱曝腸和頭抱曲松間加“or”。六、關于藥敏質控的更新M100-S20中新增的藥敏質控總結如表5:七、關于藥敏試驗操作的更新(1)在進行稀釋法藥敏試驗時，操作人員需要了解制備抗生素母液所需的溶解液和稀釋液，M100-S20文件中增加了對三種抗菌藥物母液制備所需溶解液和稀釋液的注釋：Besifloxacin的溶解液為甲醇，稀釋液為水；Fidaxomicin的溶解液為二甲基亞碉，稀釋液為水；Razupenem的溶解液和稀釋液均為pH7.2,0.01mol/L磷酸鹽緩沖液。M100-S20在表5B中總結了復合藥物藥敏試驗的母液配置原則：對于阿莫西林-克拉維酸，母液中阿莫西林和克拉維酸的濃度比應為2:1;對于氨節(jié)西林-舒巴坦，母液中氨