免疫標(biāo)記技術(shù)

1、課程名稱：臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)課題名稱：免疫標(biāo)記技術(shù)組員：朱恩鵬 拉巴卓嘎 張燕培 汪婷婷免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。藉助于熒光顯微鏡、射線測(cè)量?jī)x、酶標(biāo)檢測(cè)儀、和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定，可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定。因此，免疫標(biāo)記技術(shù)在敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍等方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)一般免疫血清學(xué)方法。近年來(lái)，隨著分子生物

2、學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基礎(chǔ)免疫學(xué)和免疫化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展以及現(xiàn)代高新技術(shù)建立的儀器分析的應(yīng)用，免疫標(biāo)記技術(shù)也不斷完善和更新。各種新技術(shù)和新方法不斷涌現(xiàn)，至今已成為一類檢測(cè)微量和超微量生物活性物質(zhì)的免疫生物化學(xué)分析技術(shù)，在醫(yī)學(xué)和其他生物學(xué)科的研究領(lǐng)域及臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用十分廣泛。根據(jù)試驗(yàn)中所用標(biāo)記物的種類和檢測(cè)方法不同，免疫標(biāo)記技術(shù)分為免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫酶技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測(cè)定等。第一節(jié) 放射免疫技術(shù) 放射免疫標(biāo)記技術(shù)是將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法，由于此項(xiàng)技術(shù)具有靈敏度高(可檢測(cè)出毫微克(ng)至微微

3、克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物質(zhì)，特異性強(qiáng)(可分辨結(jié)構(gòu)類似的抗原)、重復(fù)性強(qiáng)、樣品及試劑用量少、測(cè)定方法易規(guī)范化和自動(dòng)化等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。因此，在醫(yī)學(xué)及其他生物學(xué)科的研究領(lǐng)域和臨床實(shí)驗(yàn)診斷中廣泛應(yīng)用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物及腫瘤標(biāo)志物等的分析與定量測(cè)定。 （一）放射免疫測(cè)定(RIA)放射免疫測(cè)定(Radio immunoassay，RIA)是1959年Yalow和Berson首先創(chuàng)建的經(jīng)典放射免疫分析技術(shù)，用于血清中胰島素含量的測(cè)定。30多年來(lái)，由于此項(xiàng)技術(shù)靈敏、特異、并已制成多種標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，使用方便，應(yīng)用范圍十分廣泛。目前國(guó)外已成功地應(yīng)用RIA檢測(cè)的物質(zhì)多達(dá)300余種，國(guó)內(nèi)研

4、究的被測(cè)物質(zhì)也達(dá)百余種，試制的RIA試劑盒已有60余種，是測(cè)定各種微量物質(zhì)不可缺少的手段。（二）免疫放射測(cè)定 (IRMA)1968年Miles和Hales應(yīng)用同位素標(biāo)記的抗胰島素抗體檢測(cè)牛血清中胰島素獲得成功，為了區(qū)別于經(jīng)典的放射免疫測(cè)定(RIA)，他們將其稱為免疫放射測(cè)定或免疫放射度量分析(IRMA)。由于在反應(yīng)系統(tǒng)中使用過(guò)量的標(biāo)記抗體，且無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)，因此抗體與待測(cè)抗原達(dá)到結(jié)合狀態(tài)的化學(xué)平衡，在2-3h即可完成，較少受到抗體親和常數(shù)的限制，即使單克隆抗體的親和力較低，也能滿足試驗(yàn)要求。同時(shí)一個(gè)抗原分子可以結(jié)合多個(gè)標(biāo)記抗體分子，使IRMA的靈敏度明顯高于RIA?；驹恚篒RMA是待測(cè)抗

5、原與過(guò)量標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)綜合反應(yīng)，然后加入固相的抗原免疫吸附劑以結(jié)合游離的標(biāo)記抗體，離心除去沉淀，測(cè)定上清液中放射性強(qiáng)度從而推算出檢品中抗原含量。第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是將免疫反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性及顯微術(shù)的精確性相結(jié)合的免疫標(biāo)記技術(shù)。以熒光素作為標(biāo)記物與抗體結(jié)合成為熒光抗體，但不影響抗體的免疫學(xué)活性。用已知的熒光抗體檢測(cè)待檢標(biāo)本中的未知抗原，如果彼此相互對(duì)應(yīng)，則在局部形成熒光素標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物。熒光素受到紫外光照射時(shí)能發(fā)出可見(jiàn)熒光，可借助熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。近年來(lái)，免疫熒光技術(shù)已有很大改進(jìn)和發(fā)展，已從原來(lái)僅限于固定標(biāo)本，

6、檢測(cè)組織切片或細(xì)胞表面Ag或血清中抗體的定性檢測(cè)，擴(kuò)大到進(jìn)行活細(xì)胞分類檢測(cè)及多種成分的定量檢測(cè)，因此具有較廣泛的用途。 （一） 熒光及熒光素?zé)晒馐侵?個(gè)分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素是-種能吸收激發(fā)光的光能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使用的有機(jī)化合物，亦稱熒光色素。目前用于標(biāo)記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃(FITC)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。 （二） 熒光抗體染色方法直接法：這是熒光抗體技術(shù)最簡(jiǎn)單和基本的方法。滴加熒光抗體于待檢標(biāo)本片上，經(jīng)反應(yīng)和洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。標(biāo)本中如有相應(yīng)抗原存在，即與熒光抗體特異結(jié)合，在鏡下可見(jiàn)有熒光的

7、抗原抗體復(fù)合物。此法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、特異。但其缺點(diǎn)是檢查每種抗原均需制備相應(yīng)的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法。間接法：先將待測(cè)抗體(第一抗體)加在含有已知抗原的標(biāo)本片上作用一定時(shí)間，洗去未結(jié)合的抗體。然后，滴加標(biāo)記抗抗體。如果第一步中的抗原抗體已發(fā)生結(jié)合，此時(shí)加入的標(biāo)記抗抗體就和已固定在抗原上的抗體(一抗)分子結(jié)合，形成抗原-抗體-標(biāo)記抗抗體復(fù)合物，并顯示特異熒光。此法的優(yōu)點(diǎn)是敏感性高于直接法，而且無(wú)需制備一種熒光素標(biāo)記的抗球蛋白抗體，就可用于檢測(cè)同種動(dòng)物的多種抗原抗體系統(tǒng)。間接法有時(shí)易產(chǎn)生非特異性熒光，為其缺點(diǎn)。此法常用于各種自身抗體的檢測(cè)。 熒光顯微鏡根據(jù)其光路不同可分為透射光熒光顯微鏡

8、和落射光熒光顯微鏡兩大類。熒光顯微鏡組成成像系統(tǒng)的光具組必須無(wú)自發(fā)熒光特性。 (1)熒光光源 能發(fā)射豐富的紫外光和紫蘭光。常用高壓汞燈、氙燈、鹵鎢燈等。高壓汞燈的光源中以380、449、600nm波長(zhǎng)為主，是較為理想的熒光光源。 (2)濾光片系統(tǒng) 熒光顯微鏡的濾光片種類主要有， 吸熱濾光片 選擇性吸收紅外光熱輻射線，防止損傷光具組。 激發(fā)濾光片 選擇性吸收長(zhǎng)波譜線而只通過(guò)紫外線、紫色、藍(lán)色和綠色光線，而激發(fā)熒光素發(fā)出熒光。 阻擋濾光片 選擇性吸收短波譜線和紅外線而通透較長(zhǎng)波可視線，以便觀察到熒光并保護(hù)眼睛。 色光分離濾光片 只用于落射光熒光顯微鏡，可將激發(fā)光反射到標(biāo)本上，使標(biāo)本發(fā)出熒光，再將熒

9、光透射到目鏡的濾光反射鏡。 激發(fā)光束必須通過(guò)載物玻片，為了減少激發(fā)光線損失，必需使用昂貴的石英載物片和蓋玻片。 使用方法： (1)將熒光顯微鏡置暗室，開(kāi)啟光源，待光源穩(wěn)定并達(dá)到一定亮度(約510分鐘)后，對(duì)準(zhǔn)光軸。 (2)裝好配對(duì)的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察，操作同顯微鏡。 注意事項(xiàng)： (1)如用高壓汞燈作光源，使用時(shí)一經(jīng)開(kāi)啟不宜中斷。斷電后需待汞燈冷卻后(約15分鐘)方能再啟動(dòng)。 （2）觀察標(biāo)本時(shí)間不宜太長(zhǎng)，因標(biāo)本在高壓泵燈下照射超過(guò)3分鐘，即有熒光減弱現(xiàn)象。第三節(jié) 酶免疫技術(shù)免疫酶技術(shù)是將酶的催化放大作用和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶標(biāo)記抗原或抗體后形成的酶標(biāo)記物

10、，既保留抗原或抗體的免疫活性，又保留了酶的催化活性。當(dāng)酶標(biāo)記物與待檢標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體相互作用時(shí)，可形成酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物。利用復(fù)合物上標(biāo)記的酶催化無(wú)色的底物顯色，其顏色的深淺與待檢標(biāo)本中抗原或抗體的量相關(guān)。免疫酶技術(shù)分為酶免疫組織化學(xué)技術(shù)和酶免疫測(cè)定兩大類，目前已發(fā)展成形式各異，各有其優(yōu)點(diǎn)和用途的定位、定量、半定量和超微量分析的技術(shù)。在酶免疫技術(shù)中引進(jìn)放大系統(tǒng)，使測(cè)定的靈敏度達(dá)到10-19mol/L，優(yōu)于放射免疫測(cè)定，更重要的是沒(méi)有放射性污染，酶標(biāo)記物有效期長(zhǎng)，不需要昂貴的儀器等。 一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay , ELISA

11、）ELISA是根據(jù)酶免疫測(cè)定原理發(fā)展的一種固相免疫酶技術(shù)。其原理是：抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面仍保持免疫活性；抗原或抗體與酶結(jié)合形成的結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶活性；結(jié)合物與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，免疫復(fù)合物上標(biāo)記的酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)，可以催化底物水解、氧化還原，從而產(chǎn)生有色物質(zhì)，其顏色的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原有關(guān)。ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。ELISA有三種基本類型：間接法、雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法。（一）間接法測(cè)抗體

12、間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種

13、與抗原相應(yīng)的抗體。（二） 雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。（2）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。（3）加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾

14、心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。（三） 雙位點(diǎn)一步法在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。（四）競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。（2）待測(cè)管中加受檢標(biāo)

15、本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。（五）捕獲法測(cè)IgM抗體血清中針對(duì)某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時(shí)存在，后者會(huì)干擾IgM抗體的測(cè)定。因此測(cè)定

16、IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM。操作步驟如下：（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。（2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。（4）加入針對(duì)特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為陽(yáng)性反應(yīng)第四節(jié)     

17、   化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是近十年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析。它具有高靈敏度、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)便快速、標(biāo)記物穩(wěn)定性好、無(wú)污染、儀器簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。它是放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫分析重要的發(fā)展方向。CLIA發(fā)展迅猛，已占各種免疫分析的首位?；瘜W(xué)發(fā)光是一種特異的化學(xué)反應(yīng)，有機(jī)分子吸收化學(xué)能后發(fā)生能級(jí)躍遷，產(chǎn)生一種高能級(jí)的電子激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定的中間體，當(dāng)其返回到基態(tài)而發(fā)出光子，即為化學(xué)發(fā)光。將化學(xué)發(fā)光與抗原抗體相結(jié)合而形成的免疫分析技術(shù)，即為化學(xué)發(fā)光免疫分析。化

18、學(xué)發(fā)光的發(fā)光類型通常分為閃光型（flash type）和輝光型（glow type）兩種。閃光型發(fā)光時(shí)間很短，只有零點(diǎn)幾秒到幾秒。輝光型又稱持續(xù)型，發(fā)光時(shí)間從幾分鐘到幾十分鐘，或幾小時(shí)至更久。閃光型的樣品必須立即測(cè)量，必須配以全自動(dòng)化的加樣及測(cè)量?jī)x。測(cè)量輝光型的樣品可以使用通用型儀器，也可以配有全自動(dòng)化儀器。 化學(xué)發(fā)光免疫分析的研究現(xiàn)狀：類型原理及試劑發(fā)光類型化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA） 用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記抗原或抗體組成 吖啶酯（acrydinum esters）閃光型化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 不用化學(xué)發(fā)光物直接標(biāo)記免疫制劑。在酶免疫分析完成后加入化學(xué)

19、發(fā)光底物，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光 1.         辣根過(guò)氧化物酶(HRP)/H2O2/Luminol系統(tǒng) 輝光型1.2. 堿性磷酸酶(AP)/1，2二氧乙烷穩(wěn)定衍生物（AMPPD）系統(tǒng) 輝光型 電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA） 應(yīng)用電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與電化學(xué)手段相結(jié)合產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的免疫分析三聯(lián)吡啶釕（Rucbpy）32+三丙胺氨系統(tǒng) 閃光型 第五節(jié) 生物素-親和素技術(shù)親和素（avidin）是一種糖蛋白，分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。親和素可由蛋清中提取，但目前使用較多的是從鏈霉菌中提取的鏈菌蛋白（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶