化妝品安全技術(shù)規(guī)范

1、附件2細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)Bacterial Reverse Mutation Assay1范圍本規(guī)范確定了細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測(cè)。2 定義2.1 回復(fù)突變 reverse mutation細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營(yíng)養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。2.2 基因突變 gene mutation在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞 DNA 中堿基對(duì)的排列順序發(fā)生變化。2.3 堿基置換突變 base substitution mutation引起 DNA 鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換。堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(trans

2、version)兩種形式。轉(zhuǎn)換是 DNA 鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘌呤所代替。顛換是 DNA 鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘧啶所代替。2.4 移碼突變 frameshift mutation引起 DNA 鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。2.5 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)Bacterial reverse mutation assay利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型原養(yǎng)型回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。2.6 S9經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和-萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g 下離心

3、10min 后的肝勻漿上清液。3原理鼠傷寒沙門(mén)氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)；大腸桿菌色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng) 型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的 S9 混合液。4儀器和設(shè)備培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度 0.1g 和 0.0001g

4、)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器、低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿等。5 培養(yǎng)基和試劑5.10.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液成分：L-組氨酸（MW155）78mgD-生物素（MW244）122mgL-色氨酸（MW204）102mg加蒸餾水至1000ml配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在 0.068MPa 下高壓滅菌 20min。貯于 4冰箱。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。5.2頂層瓊脂培養(yǎng)基成分： 瓊脂粉1.2g氯化鈉1.0g加蒸餾水至 200mL配制：上述成分混合后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入 0

5、.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液 20mL。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。5.3Vogel-Bonner (V-B) 培養(yǎng)基 E成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O)100g磷酸氫二鉀(K2HPO4)500g磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O)175g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)10g加蒸餾水至1000mL配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至 1000mL。于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。儲(chǔ)于 4冰箱。5.420%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加

6、蒸餾水至1000mL配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲(chǔ)于 4冰箱。5.5底層瓊脂培養(yǎng)基成分：瓊脂粉7.5g蒸餾水480mLV-B 培養(yǎng)基 E10mL20%葡萄糖溶液10mL配制：首先將前兩種成分于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min 后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿 25mL 制備平板，冷凝固化后倒置于 37培養(yǎng)箱中 24h，備用。5.6營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基成分：牛肉膏2.5g胰胨5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.0g加蒸餾水至500mL配制：將上述成分混合后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。

7、儲(chǔ)于 4冰箱。5.7鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)成分：氯化鉀(KCl)61.5g氯化鎂(MgCl2·6H2O)40.7g加蒸餾水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。儲(chǔ)于 4冰箱。5.80.2mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7.4)成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)2.965g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)29.015g加蒸餾水至500mL配制：溶解上述成分后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。儲(chǔ)于 4冰箱。5.9S9 混合液成分每毫升 S9 混合液

8、肝 S9100l鹽溶液20l滅菌蒸餾水380l0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液500l輔酶 II(NADP)4mol6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mol配制：將輔酶 II 和 6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分， 使肝 S9 加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剩余 S9 混合液應(yīng)該丟棄。5.10菌株鑒定用和特殊用途試劑5.10.1組氨酸-色氨酸-生物素平板成分：瓊脂粉15g 蒸餾水 934mL (V-B)培養(yǎng)基 E 20mL 20%葡萄糖 20mL 滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL滅菌鹽酸色氨酸水溶液

9、(0.5g/100mL) 10mL滅菌 0.5mmol/L 生物素溶液6mL配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌 20%葡萄糖，V-B 培養(yǎng)基、組氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時(shí)蒸餾水改為944ml）。待溶液稍微冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。5.10.2氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板成分：瓊脂粉15g蒸餾水 930mL(V-B)鹽溶液20mL20%葡萄糖20mL滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL滅菌 0.5mmol/L 生物素溶液6mL氨芐青霉素溶液(8mg/mL 于

10、0.02mol/LNaOH 中)3.15mL四環(huán)素溶液(8mg/mL 于 0.02mol/L HCl 中)0.25mL配制：瓊脂和水高壓滅菌 20min，將無(wú)菌的葡萄糖、VB 鹽溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中，混勻（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時(shí)蒸餾水改為加940ml）。冷卻至大約 50，無(wú)菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。5.10.3營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板成分：瓊脂粉7.5g營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基500mL配制：于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min 后傾注平板。6試驗(yàn)菌株及其生物學(xué)特性鑒定6.1試驗(yàn)菌株采用以下菌株作為標(biāo)

11、準(zhǔn)組合：鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1535；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97或TA97a或TA1537；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA100； 鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA102 或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）；6.2生物學(xué)特性鑒定 新獲得的或長(zhǎng)期保存的菌種，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表 1 所示。表 1試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)菌株組氨酸缺陷色氨酸缺陷脂多糖屏障缺損氨芐青霉素抗性切除修復(fù)缺損四環(huán)素抗性自發(fā)回變菌落參考數(shù)*Ames實(shí)驗(yàn)室Zeiger實(shí)驗(yàn)室TA97+/+-90180*75200*TA97a+/+-90180*75200*TA98+/+

12、-30502050TA100+/+-10020075200TA102+/+-+240320*100400*TA1535+/+-+-1035520TA1537+/+-+-315520WP2uvrA/+/-+-/520WP2uvrA（pKM101）/+/+-/100200注“+”表示需 要組氨酸“+”表示需 要色氨酸“+”表示具 有 rfa 突變“+”表示具 有 R 因子“+”表示對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有uvrB突變，對(duì)于大腸桿菌，具有uvrA突變“+”表示具 有 pAQ1 質(zhì)粒*在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌落數(shù)略增。對(duì)于各菌的自發(fā)回變范圍，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室在參考其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上應(yīng)建立自己的歷史對(duì)

13、照數(shù)據(jù)庫(kù)，形成適合本實(shí)驗(yàn)室條件的適用范圍。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與文獻(xiàn)報(bào)道相符。6.2.1組氨酸缺陷/色氨酸缺陷原理：組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成組氨酸，只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長(zhǎng)。色氨酸缺陷試驗(yàn)菌株本身不能合成色氨酸，只能在補(bǔ)充色氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長(zhǎng)。鑒定方法：將測(cè)試菌株增菌液分別于含組氨酸或者色氨酸培養(yǎng)基平板和無(wú)組氨酸或者色氨酸平板上劃線，于37下培養(yǎng) 24h 后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長(zhǎng)，而在無(wú)組氨酸平板上則不能生長(zhǎng)；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生長(zhǎng)，而在無(wú)色氨酸平板上則

14、不能生長(zhǎng)。6.2.2脂多糖屏障缺損 原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì),如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從而抑制其生長(zhǎng)，而野生型菌株則不受其影響。鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液 0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的 0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37下培養(yǎng) 24h 后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：假若待測(cè)菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說(shuō)明該待測(cè)菌株具有 rfa突變。6.2.3氨芐青霉素抗性原理：含 R 因子的試驗(yàn)菌株對(duì)氨芐青霉素有抗性。因?yàn)?R 因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液 0.1

15、mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37下培養(yǎng) 24h 后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷；假若測(cè)試菌在氨芐青霉素平板上生長(zhǎng)，說(shuō)明該測(cè)試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含 R 因子，否則，表示測(cè)試菌不含 R 因子或 R 因子丟失。6.2.4紫外線敏感性原理：具有uvrB/A突變的菌株對(duì)紫外線敏感，當(dāng)受到紫外線照射后，不能生長(zhǎng)，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則能照常生長(zhǎng)。鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液 0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離 33cm）8 秒鐘。置 37下孵育 24h 后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：具有uvrB/A 突變的菌株對(duì)紫外線敏感，經(jīng)輻射后細(xì)菌不生長(zhǎng)，而具有完整

16、的切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常生長(zhǎng)。6.2.5四環(huán)素抗性原理：具有 pAQI 的菌株對(duì)四環(huán)素有抗性。鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液 0.1mL 于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置 37下孵育 24h 后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：假若測(cè)試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長(zhǎng)，表明該測(cè)試菌株對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有 pAQI 質(zhì)粒，否則，說(shuō)明測(cè)試菌株不含 pAQI 質(zhì)粒。 6.2.6自發(fā)回變?cè)恚好糠N試驗(yàn)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗(yàn)菌株的一項(xiàng)特性。鑒定方法：將待測(cè)菌株增菌液 0.1mL 加到 2mL含組氨酸-色氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)（若試驗(yàn)

17、中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置 37培養(yǎng)箱中孵育 48h 后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表 1 要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。6.2.7回變特性-診斷性試驗(yàn) 原理：每種試驗(yàn)菌株對(duì)診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及 S9 混合液的效應(yīng)不一。鑒定方法：按照平板摻入試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。將受試物換成診斷性誘變劑。結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)某些診斷性誘變劑特有的回變結(jié)果參見(jiàn)表 2。表 2 測(cè)試菌株的回變性誘變劑劑量(g/皿)S9TA97TA98 TA100TA102TA1535TA1537WP

18、2uvrAWP2uvrA（pKM101）柔毛霉素6.0-1243123 47592/疊氮化鈉1.5-763 3000188320(0.5g)/ICR1911.0-164063 1850/鏈霉黑素0.25-inhinh inh2230/絲裂霉素 C0.5-inhinh inh2772/2,4,7-三硝基-9-芴酮0.20-83778244 40016/4-硝基-O-次苯二胺20-21601599 7980/4-硝基喹啉-N-氧化物0.5-528292 4220287/610/甲基磺酸甲酯1.0（l）-17423 27306586/敵克松50.0-26881198 183895/9-氨基吖啶50-

19、/337/2-氨基芴10+17426194 3026261/苯并（a）芘1.0+337143 937255/110(5g)/2-氨基蒽20+/ /380(5g)/300/注：inh 表示抑菌。7大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和 S9 的制備7.1 誘導(dǎo)選擇健康雄性成年大鼠，體重 200g左右。將多氯聯(lián)苯（PCB 混合物）溶于玉米油中，濃度為 200mg/mL，按 500mg/kg 體重一次腹腔注射，5d 后處死動(dòng)物，處死前禁食 12h。也可采用苯巴比妥鈉和 -萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制備。經(jīng)口或腹腔注射給予80mg/kg 苯巴比妥鈉和 80mg/kg -萘黃酮，連續(xù) 3天，處死前禁食 16h。7.2 S

20、9 制備首先，用 75%酒精消毒動(dòng)物皮毛，剖開(kāi)腹部。在無(wú)菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液 3mL。用電動(dòng)勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在 4條件下，以 9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝 2mL-3mL。儲(chǔ)存于液氮生物容器中或-80冰箱中備用。上述全部操作均在冰水浴中和無(wú)菌條件下進(jìn)行。制備肝 S9 所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9 制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。8溶劑的選擇如果受試物為水溶性

21、，可用滅菌蒸餾水作為溶劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對(duì)試驗(yàn)菌株毒性低且無(wú)致突變性的有機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加 入量為 100l。9劑量的設(shè)計(jì)決定受試物最高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)細(xì)菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。對(duì)原料而言，一般最高劑量組可為 5mg/皿或 5µl/皿。對(duì)產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無(wú)殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個(gè)劑量組。每個(gè)劑量均做三個(gè)平行平板。1

22、0試驗(yàn)操作步驟10.1增菌培養(yǎng)取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 5mL，加入無(wú)菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37振蕩（100 次/min）培養(yǎng) 10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于 1-2×109 活菌數(shù)。10.2平板摻入法實(shí)驗(yàn)時(shí)，將含0.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸）的頂層瓊脂培養(yǎng)基 2.0mL分裝于試管中，45水浴中保溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液 0.1mL，受試物溶液 0.1mL和磷酸鹽緩沖液0.5ml或者 S9 混合液 0.5mL（需代謝活化時(shí)），充分混勻，迅速傾入

23、底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于 37培養(yǎng)箱里孵育 48h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照、陽(yáng)性誘變劑對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照。11數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷記錄受試物各劑量組、空白對(duì)照（自發(fā)回變）、溶劑對(duì)照以及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。如果受試物TA1535、TA1537 、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上，受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上，并出現(xiàn)以下情形之一，則該

24、受試物判定為致突變陽(yáng)性，（1）呈劑量-反應(yīng)關(guān)系（2）任何一個(gè)劑量條件下，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)并有可重復(fù)性受試物經(jīng)上述五個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株，無(wú)論在加 S9 或未加 S9 條件下為陽(yáng)性，均可報(bào)告該受試物細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)為致突變陽(yáng)性。如果受試物經(jīng)五個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后，無(wú)論加 S9 和未加 S9 均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突變陰性。鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)修訂說(shuō)明為進(jìn)一步完善化妝品安全技術(shù)規(guī)范，針對(duì)規(guī)范實(shí)施中出現(xiàn)的問(wèn)題，結(jié)合化妝品原料及產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的要求，參考其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）中鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行修訂。一、修訂的必要性1.作為化妝品

25、安全技術(shù)規(guī)范的重要參考文獻(xiàn)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193.4-2014細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)已參考國(guó)際最新指導(dǎo)原則進(jìn)行了修訂。2.化妝品安全技術(shù)規(guī)范規(guī)定試驗(yàn)用菌株標(biāo)準(zhǔn)組合為T(mén)A97、TA98、TA100和TA102。OECD Guidelines for Testing of Chemicals： Bacterial reverse mutation test (No.471, 21st July 1997) 中推薦的菌株組合為：（1）S. typhimurium TA1535，and（2）S. typhimurium TA1537 or TA97 or TA97a，and（3）S. typhim

26、urium TA98，and（4）S. typhimurium TA100，and（5）E. coli WP2 uvrA，or E. coli WP2 uvrA (pKM101)，or S. typhimurium TA102.由于菌株TA1535對(duì)某些特殊的致突變物敏感，且TA1535（無(wú)質(zhì)粒pKM101）可以與其R因子的衍生物TA100（有質(zhì)粒pKM101）相互補(bǔ)充，故在化妝品安全技術(shù)規(guī)范規(guī)定試驗(yàn)用菌株標(biāo)準(zhǔn)組合中需加入菌株TA1535。TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重復(fù)序列，其位于相應(yīng)的組氨酸靶位點(diǎn)內(nèi)的突變敏感部位，它們對(duì)導(dǎo)致這些移碼位點(diǎn)中堿基缺失的移碼誘變劑的敏感性相似

27、，因此該三種菌株在試驗(yàn)中可相互代替。鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA102 或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）在試驗(yàn)中可以相互替代。ICH頒布的ICH S2(R1)、FDA頒布的Redbook2000和藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（2007年）中也遵循了OECD指導(dǎo)原則中對(duì)于菌株組合的要求，即TA1537、TA97和TA97a可以相互替代。TA97a是TA97的純化形式，1991年文獻(xiàn)報(bào)道TA97菌株在應(yīng)用上存在以下缺點(diǎn)：過(guò)夜培養(yǎng)的菌液活性較低、背景菌落不明顯，平皿上回復(fù)突變產(chǎn)生的菌落較細(xì)小。其原因與該菌株的uvr B基因缺失有關(guān)。因此，Ames實(shí)驗(yàn)室對(duì)TA97菌株進(jìn)行了改進(jìn),

28、改進(jìn)后的重組菌株命名TA97a以代替原來(lái)的TA97。改進(jìn)后的TA97a生長(zhǎng)特性較TA97好。目前TA97市場(chǎng)上已很難獲得，考慮到實(shí)際情況，且完善菌株組合使其更充分的反映出受試物的致突變性，需要對(duì)化妝品安全技術(shù)規(guī)范進(jìn)行修改，增加TA1535、TA97a和TA1537作為試驗(yàn)中菌株組合的選擇，制定更符合國(guó)情的化妝品安全技術(shù)規(guī)范。3.對(duì)于Ames試驗(yàn)中使用的TA97，TA98，TA100和TA102菌株，化妝品安全技術(shù)規(guī)范給出了明確的自發(fā)回變菌落數(shù)。我國(guó)最新的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（GB15193.4-2014）給出了Ames實(shí)驗(yàn)室和Zeiger實(shí)驗(yàn)室兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的自發(fā)回復(fù)突變數(shù)的范圍供參考

29、，并且同時(shí)指出：對(duì)于各菌株的自發(fā)回變范圍，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室在參考其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上應(yīng)建立自己的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，形成適合本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)用范圍。另外，國(guó)內(nèi)相關(guān)檢驗(yàn)規(guī)范及其他實(shí)驗(yàn)室的背景數(shù)據(jù)都表明不同實(shí)驗(yàn)室的菌株自發(fā)回復(fù)突變數(shù)是不同的。因此目前國(guó)際上的指導(dǎo)原則包括OECD471、ICH S2(R1)和FDA Redbook，均沒(méi)有規(guī)定菌株自發(fā)回復(fù)突變數(shù)的范圍。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)在參考其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上建立自己的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)。就以上原因，需要對(duì)化妝品安全技術(shù)規(guī)范進(jìn)行修改，要求各個(gè)實(shí)驗(yàn)室建立自己的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，使其更具有科學(xué)性。4.化妝品安全技術(shù)規(guī)范中表2給出了不同菌株的陽(yáng)性對(duì)照物作為參考，但未給出敵克

30、松的相關(guān)參考數(shù)據(jù)。敵克松已經(jīng)作為一種常用的陽(yáng)性對(duì)照物用于Ames試驗(yàn)，國(guó)內(nèi)很多實(shí)驗(yàn)室用敵克松作為菌株的陽(yáng)性對(duì)照，因此，需要對(duì)規(guī)范進(jìn)行修改，增加敵克松的相關(guān)參考數(shù)據(jù)，使規(guī)范更加完整。5.修改了數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷的內(nèi)容，使表達(dá)更加清楚、明確。二、修訂依據(jù)及文獻(xiàn)1.化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2015年版）鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)2.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB15193.4-2014細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)3.OECD Guidelines for Testing of Chemicals：Bacterial reverse mutation test (No.471, 21st July 1997)4.ICH har

31、monised tripartite guideline S2(R1)：Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use. 20115.Bruce N. Ames, Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research. 113:173-215,19836.The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. M

32、utation Research,455:29-60, 2000三、起草原則1.參考國(guó)內(nèi)和國(guó)際上關(guān)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)指導(dǎo)原則，以及國(guó)內(nèi)實(shí)際情況，結(jié)合化妝品原料及產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的要求，修訂鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法。2.充分考慮國(guó)情。根據(jù)我國(guó)化妝品衛(wèi)生規(guī)范的要求對(duì)某些內(nèi)容進(jìn)行具體化和明確化，使指導(dǎo)原則切實(shí)可行。3.在撰寫(xiě)過(guò)程中，還注意了科學(xué)性、合理性、協(xié)調(diào)性和有效性，以及通俗性和規(guī)范性之間的關(guān)系。 鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)編制說(shuō)明 一、編制說(shuō)明本次修訂，主要變化如下修改了試驗(yàn)名稱；修改了1 試驗(yàn)范圍；修改了2.5 細(xì)菌回復(fù)突變的定義；修改了3 試驗(yàn)原理內(nèi)容；修改了5.1 組

33、氨酸-生物素配制的方法；修改了5.2頂層瓊脂培養(yǎng)基配制方法；修改了5.10.1組氨酸-生物素平板的制備方法；修改了5.10.2氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板的制備方法；修改了6.1試驗(yàn)菌株內(nèi)容；修改了表1試驗(yàn)菌株鑒定的內(nèi)容；修改了6.2.1組氨酸缺陷/色氨酸缺陷 原理；修改了6.2.4紫外線敏感性的種類(lèi)；修改了6.2.6鑒定方法；修改了表2 測(cè)試菌株的回變性內(nèi)容；修改了10.2 平板摻入法內(nèi)容；修改了11數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷的內(nèi)容。二、確定相關(guān)技術(shù)內(nèi)容及新舊技術(shù)規(guī)范的對(duì)比新修訂的鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)修改了試驗(yàn)用菌株的要求，菌株鑒定的內(nèi)容，相關(guān)試劑配制的內(nèi)容，數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷的內(nèi)

34、容，與原方法的差異如下表所示。表 主要內(nèi)容修訂簡(jiǎn)表編號(hào)試驗(yàn)項(xiàng)目原方法現(xiàn)方法改動(dòng)情況序號(hào)內(nèi)容序號(hào)內(nèi)容1題目8 鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay8 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)Bacterial Reverse Mutation Assay修改試驗(yàn)名稱2范圍1本規(guī)范 確定了鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法1本規(guī)范確定了細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法修改試驗(yàn)名稱3定義2.5鼠傷寒沙門(mén)氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)salmonella typhimurium/reverse mutation assay2.5細(xì)

35、菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)Bacterial reverse mutation assay修改試驗(yàn)名稱4定義2.5利用一組鼠傷寒沙門(mén)氏組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起沙門(mén)氏菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)原養(yǎng)型(his+)回復(fù)突變的試驗(yàn)方法2.5利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型原養(yǎng)型回復(fù)突變的試驗(yàn)方法修改定義5原理3鼠傷寒沙門(mén)氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致

36、突變物3鼠傷寒沙門(mén)氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)；大腸桿菌色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物增加大腸桿菌的試驗(yàn)原理6培養(yǎng)基和試劑5.10.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液5.10.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液增加色氨酸7培養(yǎng)基和試劑5.2配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅

37、菌30min。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液20mL5.2配制：上述成分混合后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入  0.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液 20mL 增加色氨酸配制方法8培養(yǎng)基和試劑組氨酸-生物素平板組氨酸-色氨酸-生物素平板增加組氨酸-色氨酸-生物素平板配制方法9氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)修改氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板配制方

38、法10試驗(yàn)菌株6.1采用 TA97、TA98、TA100和TA102一組標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株6.1采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合：鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1535；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97或TA97a或TA1537；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98；鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA100； 鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA102 或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）增加了菌株的選擇11生物學(xué)特性鑒定6.2無(wú)6.2（1）TA97a、TA1535、TA1537、WP2uvrA和WP2uvrA（pKM101）鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)（2）自發(fā)回變菌落數(shù)在參考其他實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上應(yīng)建立自己的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)，形成適合本實(shí)驗(yàn)室條件的適用范圍。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與文獻(xiàn)報(bào)道相符增加了TA97a、TA1535、TA1537、W