流式細(xì)胞儀的原理與應(yīng)用2

1、焦焦 鵬鵬 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是是2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代發(fā)展起來(lái)的一種以流式細(xì)胞儀為年代發(fā)展起來(lái)的一種以流式細(xì)胞儀為工具，能快速測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，工具，能快速測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)、抗、蛋白質(zhì)、抗原等，并可對(duì)其分類、收集的高新技術(shù)。原等，并可對(duì)其分類、收集的高新技術(shù)。 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）借鑒了熒光顯微鏡技術(shù), 同時(shí)利用計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)等多門高新技術(shù)的發(fā)展, 將熒光顯微鏡的激發(fā)光源改為激光, 使之具有更好的單色性與激發(fā)

2、效率, 因而大大提高了檢測(cè)靈敏度, 同時(shí)將固定的標(biāo)本臺(tái)改為流動(dòng)的單細(xì)胞懸液, 用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 從而大大提高了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)精確性, 而且從同一個(gè)細(xì)胞中可以同時(shí)測(cè)得多項(xiàng)參數(shù), 被譽(yù)為是細(xì)胞分析領(lǐng)域的“CT”。 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）以其快速、靈活、大量、靈敏和定量的特色，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐各個(gè)方面，包括細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)學(xué)等，在各學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 是一種能快速測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)的高技是一種能快速測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)的高技術(shù)。術(shù)。利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速、直線、流動(dòng)狀態(tài)中利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速、直

3、線、流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。與傳統(tǒng)時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。與傳統(tǒng)熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)， 成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。6一流式細(xì)胞儀的原理一流式細(xì)胞儀的原理二流式細(xì)胞儀在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用二流式細(xì)胞儀在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用81973年世界第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀年世界第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACS I（Fluorescence Activated Cell

4、 Sorter）1980年中國(guó)第一臺(tái)流式細(xì)胞儀年中國(guó)第一臺(tái)流式細(xì)胞儀FACS II北師大北師大生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域域流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀的工作原理 待測(cè)樣品制成待測(cè)樣品制成單個(gè)細(xì)胞的懸液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料對(duì)細(xì)胞（或表面抗，經(jīng)特異性熒光染料對(duì)細(xì)胞（或表面抗原等）原等）染色染色后放入上樣管中，在清潔氣體的壓力下將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，后放入上樣管中，在清潔氣體的壓力下將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，與此同時(shí)，不含細(xì)胞的磷酸鹽緩沖液（鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液與此同時(shí)，不含細(xì)胞的磷

5、酸鹽緩沖液（鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流管入口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過(guò)檢動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域。測(cè)區(qū)域。 流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束，垂直照流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束，垂直照 在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。 10 前向角散

6、射，即前向角散射，即FSC，與細(xì)胞直徑成正相關(guān)，所以我們平時(shí)上機(jī)的時(shí)與細(xì)胞直徑成正相關(guān)，所以我們平時(shí)上機(jī)的時(shí)候，有時(shí)用候，有時(shí)用FSC做閾值，排除碎片及其它顆粒，避免干擾。做閾值，排除碎片及其它顆粒，避免干擾。 側(cè)向角散射，即側(cè)向角散射，即SSC，是指與激光束正交是指與激光束正交90度方向的散射信號(hào)，它對(duì)度方向的散射信號(hào)，它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可以提供細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)及顆粒性質(zhì)的細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可以提供細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)及顆粒性質(zhì)的信息信息 這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90方向的光電倍增管接收。前方向的光電倍增管接收。前向光散射信號(hào)在前向

7、小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的向光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大小。大小。 熒光信號(hào)熒光信號(hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)熒光信號(hào)。 這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測(cè)細(xì)胞膜表面了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原抗原的強(qiáng)度或其的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)核內(nèi)物質(zhì)的濃度。的濃度。11121314液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成的液柱15 另外，通過(guò)選擇不同的單另外，通過(guò)選擇不同的單克隆克隆抗體及熒光染料，我們抗體及

8、熒光染料，我們可以利用可以利用FCM同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多種不同特征；同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多種不同特征； 如果對(duì)具有某種特征的細(xì)胞有興趣，我們還可以利如果對(duì)具有某種特征的細(xì)胞有興趣，我們還可以利用流式的分選功能將其分選出來(lái)，以便進(jìn)一步培養(yǎng)、研用流式的分選功能將其分選出來(lái)，以便進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。究。 16應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍凡是能被熒光素標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒都可用流式細(xì)胞凡是能被熒光素標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒都可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。儀檢測(cè)。前提這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源前提這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)激發(fā)在生物檢測(cè)技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的在生物檢測(cè)技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)

9、多一機(jī)多用用的儀器。的儀器。17流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer）是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，可以每秒鐘分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)。其應(yīng)用范圍非常廣泛，而且還在不斷增加。當(dāng)然，細(xì)胞分選也是它的重要應(yīng)用之一。它能夠根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的光散射和熒光特征，將特定的細(xì)胞從細(xì)胞群體中分選出來(lái)。每次一個(gè)細(xì)胞。所以人們又常常將流式細(xì)胞儀稱為熒光激活細(xì)胞分選儀（fluorescence-activated cell sorter, FACS）1819流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)=細(xì)胞大小細(xì)胞大小=細(xì)胞粒度細(xì)胞粒度=細(xì)

10、胞表面面積細(xì)胞表面面積=核漿比例核漿比例=DNADNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期=RNARNA含量含量=蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞功能細(xì)胞功能=細(xì)胞表面細(xì)胞表面/ /胞漿胞漿/ /核的核的特異性抗原特異性抗原=細(xì)胞活性細(xì)胞活性=細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子=酶活性酶活性=激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)=細(xì)胞受體細(xì)胞受體20 1流式細(xì)胞儀的分析速度：流式細(xì)胞儀的分析速度：一般流式細(xì)胞儀每秒檢測(cè)一般流式細(xì)胞儀每秒檢測(cè)3000 6000個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞, 大型機(jī)可達(dá)每秒幾萬(wàn)個(gè)大型機(jī)可達(dá)每秒幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞。 2流式細(xì)胞儀的熒光檢測(cè)靈敏度：流式細(xì)胞儀的熒光檢測(cè)靈敏度： 一般能測(cè)出單個(gè)細(xì)胞上一般能測(cè)出單個(gè)細(xì)胞上6

11、00個(gè)熒光分子個(gè)熒光分子, 兩個(gè)細(xì)胞間的熒光差兩個(gè)細(xì)胞間的熒光差5%即可區(qū)分。即可區(qū)分。3前向角散射光（前向角散射光（FSC）檢測(cè)靈敏度：）檢測(cè)靈敏度： 前向角散射光（前向角散射光（FSC）反映被測(cè)細(xì)胞的大小）反映被測(cè)細(xì)胞的大小,一般流式細(xì)胞儀能夠測(cè)一般流式細(xì)胞儀能夠測(cè)量到量到0.2m.5m。211923經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測(cè)。經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測(cè)。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。 FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波的光學(xué)

12、系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入到不同的電子探測(cè)器。長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入到不同的電子探測(cè)器。為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。為了進(jìn)一步使檢測(cè)的發(fā)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。為了進(jìn)一步使檢測(cè)的發(fā)射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種濾片濾片。帶阻或帶通濾片帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長(zhǎng)區(qū)段的光線濾除或通過(guò)。例如使是有選擇性地使某一

13、濾長(zhǎng)區(qū)段的光線濾除或通過(guò)。例如使用用525nm帶通濾片只允許帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）異硫氰熒光素）發(fā)射的發(fā)射的525nm綠光通過(guò)。綠光通過(guò)。長(zhǎng)長(zhǎng)(短）波通過(guò)二向色性反射鏡短）波通過(guò)二向色性反射鏡只允許某一波長(zhǎng)以只允許某一波長(zhǎng)以上（下）的光線通過(guò)而將此波長(zhǎng)以下的另一特定波長(zhǎng)的光線反射。在免疫上（下）的光線通過(guò)而將此波長(zhǎng)以下的另一特定波長(zhǎng)的光線反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開(kāi)?；蚨?/p>

14、色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開(kāi)。 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)24FACSCalibur 光路圖25我中心檢測(cè)型流式細(xì)胞儀：BD FACSCalibur激光：488nm,633nm常用熒光標(biāo)記：FL1：GFP;CFSE;FITC;Alexa Flouro 488FL2：PE;PIFL3：7-AAD;PE-Cy5;PerCP;PerCP-Cy5.5;PE-Cy5.5;PE-Cy7FL4：APC; Alexa Flouro 647一般檢測(cè)項(xiàng)目：細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞周期檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子檢測(cè)26=激光激光 (Laser)(Laser)=熒光素與熒光熒光素與熒光=FACSFACS檢測(cè)的

15、信號(hào)參數(shù)檢測(cè)的信號(hào)參數(shù)27激光激光-=激光激光 (Laser)(Laser)是一種相干光源，它能提供是一種相干光源，它能提供單一波長(zhǎng)、單一方向、同步的穩(wěn)定光照單一波長(zhǎng)、單一方向、同步的穩(wěn)定光照=單色性好，方向性好，亮度高，可提高分單色性好，方向性好，亮度高，可提高分辨力辨力=激光波長(zhǎng)激光波長(zhǎng): 488nm, 635nm: 488nm, 635nm細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源28FACSCalibur的激光系統(tǒng)的激光系統(tǒng)=FITC Fluorescein isothiocyanateFITC Fluorescein isothiocyanate=PE Phycoe

16、rythrinPE Phycoerythrin=PerCP Peridinin chorophyll proteinPerCP Peridinin chorophyll protein=APC AllophycocyaninAPC Allophycocyanin=PI Propidium iodidePI Propidium iodide600nm300nm500nm700nm400nm457350514610 632488CommonLaserLines=熒光素標(biāo)記特異抗體熒光素標(biāo)記特異抗體=熒光素吸收激光能量，產(chǎn)生躍遷熒光素吸收激光能量，產(chǎn)生躍遷=回到基態(tài)，熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換回到基

17、態(tài)，熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為振動(dòng)能和熱能，釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)為振動(dòng)能和熱能，釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子的光量子=熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng)光信號(hào)越強(qiáng)=雙激光，兩點(diǎn)激發(fā)，實(shí)現(xiàn)雙激光，兩點(diǎn)激發(fā)，實(shí)現(xiàn)4 4色熒光分析色熒光分析=最大程度地減少熒光信號(hào)之間的最大程度地減少熒光信號(hào)之間的補(bǔ)償補(bǔ)償，提，提高檢測(cè)靈敏度高檢測(cè)靈敏度=雙激光的應(yīng)用大大擴(kuò)展了染料的選擇范圍，雙激光的應(yīng)用大大擴(kuò)展了染料的選擇范圍，亦相應(yīng)地?cái)U(kuò)大了儀器的應(yīng)用領(lǐng)域亦相應(yīng)地?cái)U(kuò)大了儀器的應(yīng)用領(lǐng)域33 當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光素如當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光素如PEPE和和FITC, FITC,

18、 受激光激發(fā)而發(fā)射受激光激發(fā)而發(fā)射出兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，理論上，可選擇濾片使每種熒出兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，理論上，可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測(cè)器檢測(cè)到，而不會(huì)檢測(cè)到另一種熒光。光僅被相應(yīng)的檢測(cè)器檢測(cè)到，而不會(huì)檢測(cè)到另一種熒光。但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定然它們之間各自發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，的重疊，F(xiàn)ITCFITC探測(cè)器會(huì)探測(cè)到少量的探測(cè)器會(huì)探測(cè)到少量的PEPE光譜，而光譜，而PEPE探測(cè)器探測(cè)器則檢測(cè)到較多的則檢測(cè)到較多的FITCFITC光譜。

19、克服這種誤差的最有效方法是光譜?？朔@種誤差的最有效方法是使用熒光補(bǔ)償電路使用熒光補(bǔ)償電路光譜重疊的校正光譜重疊的校正343536=前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward ScatterFSC, Forward Scatter）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 =側(cè)向角散射（側(cè)向角散射（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter）細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性Right Angle Light Detector Cell ComplexityForward Light Detector Cell Surface Area

20、Incident Light Source38FSC和和SSC兩種信號(hào)都是來(lái)自于激光原光束，其波長(zhǎng)與激光相同，目前兩種信號(hào)都是來(lái)自于激光原光束，其波長(zhǎng)與激光相同，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細(xì)胞處理后外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細(xì)胞處理后外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞群體，或在未進(jìn)行裂解紅細(xì)胞處理的全血樣品中單核細(xì)胞和粒細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞群體，或在未進(jìn)行裂解紅細(xì)胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細(xì)胞等細(xì)胞群體。找出血小板和紅細(xì)胞等細(xì)胞群體。外周血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（裂解紅細(xì)胞后）外周血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（裂解紅細(xì)胞后）39 測(cè)得的測(cè)得的FSFS

21、與與SSSS信信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到可得到FS-SSFS-SS圖，由圖，由此可僅用散射光信號(hào)此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。行分析或分選。 此為血細(xì)胞分類此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測(cè)量最有效用途：光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群從非均一群體中鑒別出某些亞群 使用不同熒光素標(biāo)記不同單克隆抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，做多色分析使用不同熒光素標(biāo)記不同單克隆抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量

22、熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量雙色直接染色雙色直接染色394043液流系統(tǒng)：流動(dòng)室、液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)液流系統(tǒng)：流動(dòng)室、液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計(jì)和制作均很精細(xì)，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度。由于鞘液的作用，被檢測(cè)細(xì)胞被限制在液流的軸線上。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。 液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成的液柱液流中心由單列勻速運(yùn)動(dòng)顆粒組成的液柱流式細(xì)胞儀的電子系統(tǒng)流式細(xì)胞

23、儀的電子系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)和分析進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)和分析= 當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物, ,通過(guò)激光照射區(qū)時(shí)通過(guò)激光照射區(qū)時(shí), ,受到激發(fā)受到激發(fā), , 產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的、代產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的、代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號(hào)表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號(hào)= 經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。光電倍增管（PMT）最為常用。 = 從從PMT輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。 = 數(shù)字信號(hào)傳送

24、到計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)把所測(cè)量到的各種信號(hào)進(jìn)行處理、儲(chǔ)存、數(shù)字信號(hào)傳送到計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)把所測(cè)量到的各種信號(hào)進(jìn)行處理、儲(chǔ)存、 作圖、作圖、 統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析, ,將分析結(jié)果顯示將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，也可以打印出來(lái)，還可以數(shù)據(jù)文件在計(jì)算機(jī)屏幕上，也可以打印出來(lái)，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲(chǔ)在硬盤上以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。的形式存儲(chǔ)在硬盤上以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。=MacintoshiMacintoshi系統(tǒng)，靈活多樣的圖形處理能力系統(tǒng)，靈活多樣的圖形處理能力 目前公認(rèn)的最佳圖像處理系統(tǒng),使流式細(xì)胞儀的功能發(fā)揮更加完美。 強(qiáng)大的軟件支持，靈活方便的數(shù)據(jù)處理功能強(qiáng)大的軟件支持，靈活方便的數(shù)據(jù)處理

25、功能=儀器自動(dòng)校檢軟件儀器自動(dòng)校檢軟件FACSCompFACSComp=主軟件主軟件CELLQuestCELLQuest=全面的自動(dòng)化臨床應(yīng)用軟件：全面的自動(dòng)化臨床應(yīng)用軟件：淋巴細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)軟件淋巴細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)軟件SimulSETSimulSET；MultiSETMultiSET干細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)軟件干細(xì)胞自動(dòng)檢測(cè)軟件ProCOUNTProCOUNTHLA-B27HLA-B27； ModFITModFIT；47 根據(jù)分析目的不同，對(duì)制備好的樣本在流式細(xì)胞儀上根據(jù)分析目的不同，對(duì)制備好的樣本在流式細(xì)胞儀上測(cè)量其光散射和熒光強(qiáng)度。一般在測(cè)樣本前先應(yīng)用熒光標(biāo)測(cè)量其光散射和熒光強(qiáng)度。一般在測(cè)樣本前先應(yīng)用熒

26、光標(biāo)準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器，多色分析準(zhǔn)微球校準(zhǔn)儀器，多色分析 時(shí)還應(yīng)進(jìn)行顏色補(bǔ)償，以避免時(shí)還應(yīng)進(jìn)行顏色補(bǔ)償，以避免多色熒光間信號(hào)的相互干擾。多色熒光間信號(hào)的相互干擾。 儀器校準(zhǔn)后測(cè)量樣本，每個(gè)細(xì)胞的光散射及熒光測(cè)量?jī)x器校準(zhǔn)后測(cè)量樣本，每個(gè)細(xì)胞的光散射及熒光測(cè)量數(shù)據(jù)一般以列表或矩陣方數(shù)據(jù)一般以列表或矩陣方 式儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中，然后進(jìn)行數(shù)式儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯示、圖象分析和結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理，最終獲得所分析細(xì)據(jù)的顯示、圖象分析和結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理，最終獲得所分析細(xì)胞的信息，也可在測(cè)定的同時(shí)進(jìn)行結(jié)果分析。胞的信息，也可在測(cè)定的同時(shí)進(jìn)行結(jié)果分析。 =數(shù)據(jù)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)存儲(chǔ): List Mode: List Mode4

27、9 數(shù)據(jù)的顯示數(shù)據(jù)的顯示 儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)文件雖然易于加工、處理、分析，但由于數(shù)據(jù)大，儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)文件雖然易于加工、處理、分析，但由于數(shù)據(jù)大，又缺乏直觀性，不利于觀察各參數(shù)及其相互的關(guān)系。因此，將又缺乏直觀性，不利于觀察各參數(shù)及其相互的關(guān)系。因此，將數(shù)據(jù)用圖形顯數(shù)據(jù)用圖形顯 示更直觀，然后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，這是示更直觀，然后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，這是FCM結(jié)結(jié)果分析中最常用的分析方法。果分析中最常用的分析方法。FCM數(shù)據(jù)顯示通常有一維直方圖、數(shù)據(jù)顯示通常有一維直方圖、二維點(diǎn)圖、二維密度圖、二維等高圖、假三維圖等。二維點(diǎn)圖、二維密度圖、二維等高圖、假三維圖等。50 由一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒光散射光或

28、熒光) )與顆粒計(jì)數(shù)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖51單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量細(xì)胞相對(duì)數(shù)量熒光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度值（對(duì)數(shù)） 圖中已根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)定適當(dāng)?shù)摹伴T”（直線門），儀器的計(jì)算機(jī)就會(huì)給出測(cè)定值（包括陽(yáng)性細(xì)胞%和平均熒光強(qiáng)度） 52圖中100101（M1）為陰性細(xì)胞，101以上的（M2）為陽(yáng)性細(xì)胞 53n雙參數(shù)雙參數(shù)散點(diǎn)散點(diǎn)圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位

29、置。就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。n雙參數(shù)信號(hào)雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。雙參數(shù)散點(diǎn)圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖541.雙參數(shù)散點(diǎn)圖雙參數(shù)散點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度55雙參數(shù)點(diǎn)圖雙參數(shù)點(diǎn)圖562. 二維等高圖二維等高圖n由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。雙參數(shù)直方圖。n等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)

30、等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高等高”。n曲線層次越高曲線層次越高( (越里面的線越里面的線) ) 所代表的細(xì)胞所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。數(shù)愈多。n等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。57=等高圖和密度圖分析等高圖和密度圖分析二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點(diǎn)圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線層次越高所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細(xì)胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。 583. 假三維等高圖

31、假三維等高圖59三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖三個(gè)熒光數(shù)據(jù)關(guān)系用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個(gè)數(shù)據(jù)（如用ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。 60流式細(xì)胞計(jì)是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分流式細(xì)胞計(jì)是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測(cè)量、存貯、顯選的裝置。它可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)設(shè)的參量范圍把指定量，并可以根據(jù)預(yù)設(shè)的參量

32、范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來(lái)。的細(xì)胞亞群從中分選出來(lái)。樣品分選61細(xì)胞分選的原理當(dāng)經(jīng)熒光染色或標(biāo)記的單細(xì)胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動(dòng)室內(nèi)。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的包裹和推動(dòng)下，細(xì)胞被排成單列，以一定速度從流動(dòng)室噴口噴出。在流動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻的壓電晶體，充電后振動(dòng)，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測(cè)細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)過(guò)帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，沒(méi)有充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。 62流式細(xì)胞分選的特點(diǎn)1. 少量細(xì)胞分選時(shí)，流式細(xì)胞分選精確度高（99%以上），速度快

33、。目前，先進(jìn)的流式細(xì)胞儀的分選速度可達(dá)25 000個(gè)細(xì)胞/秒以上，比傳統(tǒng)的分選速度提高了很多倍，原來(lái)需要一天的工作現(xiàn)在只需要幾小時(shí)就能完成。不過(guò)流式細(xì)胞儀分離細(xì)胞的量還是有一定的限制，一次分離的最大合理量約為108個(gè)細(xì)胞。如果細(xì)胞量超過(guò)109個(gè)，則需要耗費(fèi)10小時(shí)以上，分選后細(xì)胞的活力會(huì)受到很大的影響。2. 可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)Marker分選，正選負(fù)選同時(shí)進(jìn)行。以前的流式細(xì)胞儀只能給液滴充上正電荷或負(fù)電荷，因此在電場(chǎng)中只能向左或向右偏轉(zhuǎn)，即兩路分選。現(xiàn)在的儀器可以給液滴充以不同的電量，從而調(diào)整液滴的偏轉(zhuǎn)角度，實(shí)現(xiàn)多路分選。BD的FACSAria流式細(xì)胞儀就可以進(jìn)行四路分選。633. 不僅僅限于表

34、面抗原，流式細(xì)胞儀可以根據(jù)任何能檢測(cè)到的發(fā)光度（如細(xì)胞體積）或熒光（如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特異抗原）散射度差異來(lái)分離細(xì)胞。如果能保證流式細(xì)胞儀的無(wú)菌狀態(tài)，那么分選后的細(xì)胞還可以進(jìn)行培養(yǎng)或其他分析。4. 如果只是偶爾做幾次細(xì)胞分選的話，用流式分選還是比較劃算的，只需要準(zhǔn)備樣品和抗體，交納一定的儀器使用費(fèi)即可，不需要購(gòu)買配套的設(shè)備。=數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)MacintoshiMacintoshi系統(tǒng)系統(tǒng)=AutoloaderAutoloader自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)：自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)： 4040管輪盤，軟管輪盤，軟件支持，簡(jiǎn)單易操作，真正實(shí)現(xiàn)無(wú)人操作件支持，簡(jiǎn)單易操作，真正實(shí)現(xiàn)無(wú)人操作=樣本制備

35、儀：樣本制備儀：=免疫樣本制備儀免疫樣本制備儀=DNADNA樣本制備儀樣本制備儀666768大型機(jī)大型機(jī) FACS Vantage SE FACS Vantage SE=多激光多波長(zhǎng)多激光多波長(zhǎng)=八特征參數(shù)八特征參數(shù)=設(shè)計(jì)靈活設(shè)計(jì)靈活=高速分選高速分選=單細(xì)胞點(diǎn)對(duì)點(diǎn)分選單細(xì)胞點(diǎn)對(duì)點(diǎn)分選69臺(tái)式機(jī)臺(tái)式機(jī) FACSCalibur FACSCalibur=雙激光：雙激光：488nm/635nm488nm/635nm=四熒光六分析參數(shù)四熒光六分析參數(shù)=自動(dòng)化程度高自動(dòng)化程度高=分析速度快分析速度快=靈活的設(shè)計(jì)靈活的設(shè)計(jì)=細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞富集系統(tǒng)細(xì)胞富集系統(tǒng)7071最簡(jiǎn)化的樣本處理過(guò)程，很好

36、地防生物污染最簡(jiǎn)化的樣本處理過(guò)程，很好地防生物污染完善的自動(dòng)采樣，自動(dòng)分析出報(bào)告系統(tǒng)，防人為因素干擾完善的自動(dòng)采樣，自動(dòng)分析出報(bào)告系統(tǒng)，防人為因素干擾嚴(yán)格完整地質(zhì)控及對(duì)照系統(tǒng)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，可靠性嚴(yán)格完整地質(zhì)控及對(duì)照系統(tǒng)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，可靠性完善的完善的CD4CD4，CD8CD8，CD3CD3絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)專為專為HIVHIV監(jiān)測(cè)設(shè)計(jì)的經(jīng)濟(jì)普及型流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)設(shè)計(jì)的經(jīng)濟(jì)普及型流式細(xì)胞儀727374雙激光五色七參數(shù)分析雙激光五色七參數(shù)分析自動(dòng)補(bǔ)償自動(dòng)補(bǔ)償Windows Windows 操作系統(tǒng)操作系統(tǒng)757677 流式細(xì)胞術(shù)樣本來(lái)源流式細(xì)胞術(shù)樣本來(lái)源 流式樣品的制備中應(yīng)注意的幾

37、個(gè)問(wèn)題流式樣品的制備中應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題 熒光染色的步驟熒光染色的步驟=細(xì)胞懸液：細(xì)胞懸液：=培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞系培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞系=灌洗液、體腔積液灌洗液、體腔積液=分離分離PBMCPBMC、PRPPRP等：操作復(fù)雜，分離、離心步驟導(dǎo)致細(xì)胞特等：操作復(fù)雜，分離、離心步驟導(dǎo)致細(xì)胞特定群體丟失，并可能引入某些誤差定群體丟失，并可能引入某些誤差=直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡(jiǎn)便，樣直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡(jiǎn)便，樣本用血量小本用血量小=實(shí)體組織：實(shí)體組織：MedimachineMedimachine (Medimachine (Medimachine 系統(tǒng)是一套安全的系統(tǒng)是一

38、套安全的, ,標(biāo)準(zhǔn)化的樣本制備系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化的樣本制備系統(tǒng), ,可對(duì)植物或動(dòng)物的實(shí)體組織進(jìn)行自動(dòng)機(jī)械分離可對(duì)植物或動(dòng)物的實(shí)體組織進(jìn)行自動(dòng)機(jī)械分離 )=病理組織：新鮮樣本病理組織：新鮮樣本/ /石蠟包埋樣本石蠟包埋樣本=針吸組織：新鮮樣本針吸組織：新鮮樣本=鞘液、洗液、鞘液、洗液、PMAPMA等：清潔無(wú)顆粒雜質(zhì)等：清潔無(wú)顆粒雜質(zhì)808182838485合適？合適？8687熒光染色熒光染色染色步驟染色步驟v表面染色：細(xì)胞表面抗原抗體反應(yīng)表面染色：細(xì)胞表面抗原抗體反應(yīng)v溶血：溶解紅細(xì)胞溶血：溶解紅細(xì)胞v破膜：細(xì)胞膜打孔，使胞內(nèi)染料滲入破膜：細(xì)胞膜打孔，使胞內(nèi)染料滲入v清洗：除去多余的染料及打孔劑清洗：除

39、去多余的染料及打孔劑v胞內(nèi)染色：細(xì)胞內(nèi)抗原抗體反應(yīng)胞內(nèi)染色：細(xì)胞內(nèi)抗原抗體反應(yīng)v清洗：除去多余的染料清洗：除去多余的染料v固定：固定細(xì)胞，準(zhǔn)備上機(jī)分析固定：固定細(xì)胞，準(zhǔn)備上機(jī)分析88 樣品培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞 懸液 標(biāo)記熒光抗體檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)操作流程統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析繼續(xù)培養(yǎng) FCM提供了一種簡(jiǎn)捷地監(jiān)測(cè)細(xì)胞亞群的方法。即通提供了一種簡(jiǎn)捷地監(jiān)測(cè)細(xì)胞亞群的方法。即通過(guò)熒光抗過(guò)熒光抗體體和抗和抗原原檢測(cè)技術(shù)對(duì)淋巴細(xì)胞膜表面分化抗原檢測(cè)技術(shù)對(duì)淋巴細(xì)胞膜表面分化抗原(CD分子分子)、細(xì)胞分類和各亞群進(jìn)行分析，并計(jì)算出淋巴、細(xì)胞分類和各亞群進(jìn)行分析，并計(jì)算出淋巴細(xì)胞各亞群的百分比，從而

40、對(duì)人體細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行評(píng)細(xì)胞各亞群的百分比，從而對(duì)人體細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原發(fā)性和繼發(fā)性估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷病、腫瘤的療效觀察和預(yù)后判斷以及器官移植免疫缺陷病、腫瘤的療效觀察和預(yù)后判斷以及器官移植的監(jiān)測(cè)上起著重要的指導(dǎo)作用。的監(jiān)測(cè)上起著重要的指導(dǎo)作用。 根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為根據(jù)功能，淋巴細(xì)胞主要分為 B B淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞（CD19+CD19+），與體液免疫有關(guān)），與體液免疫有關(guān) T T淋巴細(xì)胞（淋巴細(xì)胞（CD3+CD3+），與細(xì)胞免疫有關(guān)），與細(xì)胞免疫有關(guān) NKNK細(xì)胞（細(xì)胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16

41、+56+），行使免疫監(jiān)控功能），行使免疫監(jiān)控功能 根據(jù)根據(jù)CD4CD4、CD8CD8表達(dá)，表達(dá)，T T淋巴細(xì)胞又分為淋巴細(xì)胞又分為 Th TTh T輔助輔助/ /誘導(dǎo)細(xì)胞（誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+CD3+CD4+） Ts TTs T抑制抑制/ /細(xì)胞毒性細(xì)胞（細(xì)胞毒性細(xì)胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）Th/TsTh/Ts升高：自身免疫性疾?。愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、升高：自身免疫性疾?。愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLESLE） Th/TsTh/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血 了解在不同情況下體內(nèi)免疫功能狀態(tài)了解在不同情況下體內(nèi)免疫功能狀態(tài) 輔助臨床疾

42、病的診斷輔助臨床疾病的診斷 探索疾病的發(fā)病機(jī)理、病程、預(yù)后探索疾病的發(fā)病機(jī)理、病程、預(yù)后 監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)臨床治療方案監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)臨床治療方案 免疫系統(tǒng)疾病免疫系統(tǒng)疾病 免疫缺陷病，免疫缺陷病，AIDSAIDS 移植病人排斥反應(yīng)或移植物抗宿主反應(yīng)的檢測(cè)移植病人排斥反應(yīng)或移植物抗宿主反應(yīng)的檢測(cè) 腫瘤病人化療后免疫力檢測(cè)腫瘤病人化療后免疫力檢測(cè) 樣本使用樣本使用EDTAEDTA抗凝全血，用血量抗凝全血，用血量600uL600uL 使用雙色分析試劑使用雙色分析試劑 使用使用SimulSETSimulSET自動(dòng)軟件，進(jìn)行樣本的獲取和分析自動(dòng)軟件，進(jìn)行樣本的獲取和分析 SimulSETSimulSET軟件自動(dòng)做

43、質(zhì)量檢查，幫助發(fā)現(xiàn)樣本運(yùn)軟件自動(dòng)做質(zhì)量檢查，幫助發(fā)現(xiàn)樣本運(yùn)輸、處理等過(guò)程中造成的錯(cuò)誤輸、處理等過(guò)程中造成的錯(cuò)誤 醫(yī)生報(bào)告醫(yī)生報(bào)告T T、B B、NKNK淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞及ThTh、TsTs百分含量和百分含量和Th / TsTh / Ts比值，并報(bào)告參考值范圍比值，并報(bào)告參考值范圍=CD45/CD14 (LeucoGATE)CD45/CD14 (LeucoGATE)：自動(dòng)定義淋巴細(xì)：自動(dòng)定義淋巴細(xì)胞的光散射門，并評(píng)估其有效性胞的光散射門，并評(píng)估其有效性=Isotype Control (Isotype Control ( 1 1/ / 2a2a) )：陰性對(duì)照，確：陰性對(duì)照，確定定FL1FL1

44、和和FL2FL2的非特異性結(jié)合水平，界定陰性的非特異性結(jié)合水平，界定陰性和陽(yáng)性細(xì)胞群體和陽(yáng)性細(xì)胞群體=CD3/CD19CD3/CD19：鑒別：鑒別T T淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞和B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞=CD3/CD4CD3/CD4：鑒別：鑒別T T輔助輔助/ /誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞=CD3/CD8CD3/CD8：鑒別：鑒別T T抑制抑制/ /毒性淋巴細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞=CD3/CD16+56CD3/CD16+56：鑒別：鑒別T T淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞和NKNK細(xì)胞細(xì)胞97 CD45/CD14 LeucoGATECD45/CD14 LeucoGATE： Back-GatingBack-Gating，準(zhǔn)

45、確圈定淋巴細(xì)胞門，并，準(zhǔn)確圈定淋巴細(xì)胞門，并評(píng)估門的有效性評(píng)估門的有效性 Isotype Control (Isotype Control ( 1 1/ / 2a2a) )： 陰性對(duì)照，確定陰性對(duì)照，確定FL1FL1和和FL2FL2的非特異性結(jié)合的非特異性結(jié)合水平，界定陰性和陽(yáng)性細(xì)胞群體水平，界定陰性和陽(yáng)性細(xì)胞群體 CD3/CD19CD3/CD19： 鑒別鑒別T T淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞和B B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 CD3/CD4CD3/CD4： 鑒別鑒別T T輔助輔助/ /誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞=CD3/CD8CD3/CD8：=鑒別鑒別T T抑制抑制/ /毒性淋巴細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞 CD3/CD16

46、+56CD3/CD16+56： 鑒別鑒別T T淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞和NKNK淋巴細(xì)淋巴細(xì)103BD SimulTEST IMK-Lymphocyte Kit (反反向設(shè)門法雙色淋巴細(xì)向設(shè)門法雙色淋巴細(xì)胞表型分析胞表型分析)健康中國(guó)人參考范圍健康中國(guó)人參考范圍（使用（使用SimunlSET自自動(dòng)軟件）動(dòng)軟件）項(xiàng)項(xiàng) 目目百分含量（百分含量（%淋淋巴細(xì)胞）巴細(xì)胞）Total B lymphocyte (CD19+) 5-18%NK cell (CD3-/CD16+56+) 7-40%Total T lymphocyte (CD3+) 50-84%T helper/inducer cell (CD3+/

47、CD4+) 27-51%T supressor/cytotoxic cell (CD3+/CD8+) 15-44%Th/Ts0.71-2.78=T T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少淋巴細(xì)胞總數(shù)減少=T T細(xì)胞亞群比例倒置，細(xì)胞亞群比例倒置，Th/Ts1.0Th/Ts1.0=ThTh細(xì)胞細(xì)胞(CD4+(CD4+細(xì)胞細(xì)胞) )絕對(duì)計(jì)數(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)200200個(gè)個(gè)/ml/ml=TsTs細(xì)胞增高細(xì)胞增高=NKNK細(xì)胞減少或活力下降細(xì)胞減少或活力下降=B B細(xì)胞正常細(xì)胞正常68%3.6%3.4%6.7%10%8.9% 凋亡（或程序性細(xì)胞死亡）是一個(gè)生理性的細(xì)胞自我毀滅凋亡（或程序性細(xì)胞死亡）是一個(gè)生理性的細(xì)胞自我毀滅的過(guò)

48、程，在胚胎發(fā)育、生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及多細(xì)胞生物防御的過(guò)程，在胚胎發(fā)育、生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及多細(xì)胞生物防御外在及內(nèi)在傷害方面均起著非常重要的作用。凋亡過(guò)程的紊亂，外在及內(nèi)在傷害方面均起著非常重要的作用。凋亡過(guò)程的紊亂，可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，如腫瘤、自身免可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，如腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性變及局部損傷等。能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡疫性疾病、神經(jīng)退行性變及局部損傷等。能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素很多，如射線、能夠引起染色體損傷的藥物、細(xì)胞自身的因素很多，如射線、能夠引起染色體損傷的藥物、細(xì)胞自身表達(dá)的一些受體分子等。表達(dá)的一些受體分子等。 細(xì)胞凋亡的主要檢查

49、手段細(xì)胞凋亡的主要檢查手段 形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查 LaddersLadders實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 流式細(xì)胞儀檢查流式細(xì)胞儀檢查110n流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，是常用的方法。由于流式細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，是常用的方法。由于流式細(xì)胞儀固有的特點(diǎn)儀固有的特點(diǎn)可以準(zhǔn)確的進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)?？梢詼?zhǔn)確的進(jìn)行凋亡細(xì)胞的計(jì)數(shù)。因此，具有其它方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性。因此，具有其它方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性。111線粒體功能檢測(cè)的試劑盒有深圳達(dá)科為公司代理的試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)為BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒。其檢測(cè)主要采用陽(yáng)離子型熒光染料。原理是：正常細(xì)胞中，染料可以在線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出明亮的紅色熒光；而細(xì)胞

50、凋亡后，其線粒體膜電位發(fā)生改變，染料無(wú)法進(jìn)入線粒體，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在，發(fā)出綠色的熒光。可以在熒光顯微鏡下，或流式檢測(cè)。采用488nm激發(fā)，其檢測(cè)波長(zhǎng)分別是527nm和590nm。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，只需要30min就可以見(jiàn)到結(jié)果。含量DNA周期檢測(cè)原本是用來(lái)反應(yīng)細(xì)胞各個(gè)期，即細(xì)胞增殖狀況的。利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料，如PI結(jié)合的特性。細(xì)胞各個(gè)時(shí)期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同，流式檢測(cè)的熒光強(qiáng)度也不一樣。G2M期DNA含量是G0G1的兩倍，而S期介于兩者之間。但是由于發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞DNA含量較少，因而可以在細(xì)胞G0G1期前面有一個(gè)亞二倍體峰，從而認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。但

51、是由于死亡的細(xì)胞本身其DNA含量也是減少的，因而非常難于區(qū)分凋亡和死亡的細(xì)胞。在90年代，該方法曾經(jīng)風(fēng)靡一時(shí)，現(xiàn)在看來(lái)，那時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要推敲。盡管，經(jīng)典的流式檢測(cè)資料給出的圖是認(rèn)為凋亡的細(xì)胞是緊挨著G0G1期峰的一個(gè)峰，死亡的細(xì)胞峰離G0G1期峰較遠(yuǎn)，但是這種典型的結(jié)果似乎很難獲得。有其它的替代方法，完全可以不用這種方法。下圖橫軸代表PI的熒光強(qiáng)度，縱軸代表細(xì)胞數(shù)目，各個(gè)期根據(jù)熒光強(qiáng)度可以簡(jiǎn)單的進(jìn)行區(qū)分。117 磷脂酰絲氨酸（磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻

52、轉(zhuǎn)到細(xì)胞可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為是一種分子量為3536KD的的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)高親和力特異性結(jié)合。將合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)標(biāo)記，以標(biāo)記了的記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)是一

53、種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與與PI匹配使用，就可以將匹配使用，就可以將正常細(xì)胞、凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)正常細(xì)胞、凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)磷脂酰絲氨酸外翻分析磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法法)聯(lián)合聯(lián)合PI法法118結(jié)果判斷： 正?；罴?xì)胞Annexin V 、PI均低染； 凋亡早期細(xì)胞Annexin V高染、PI低染； 壞死細(xì)胞 、凋亡晚期Annexin V/PI均高染。119 應(yīng)用價(jià)值：應(yīng)用

54、價(jià)值：細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的PS外露早于外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合聯(lián)合PI染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡較較TUNEL法更為靈法更為靈敏。又敏。又Annexin V聯(lián)合聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞，可避免染色不需固定細(xì)胞，可避免PI染色染色檢檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)因固定造成的細(xì)胞碎片過(guò)多及因固定造成的細(xì)胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出法因固定出現(xiàn)的現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結(jié)法更加省時(shí)，結(jié)果更為可靠果更為可靠。是目前最為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。是目前最為理想的檢

55、測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。 120121TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞凋亡中染色體細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過(guò)程，染色體的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過(guò)程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然的大片段。然后大約后大約30 的染色體的染色體DNA在在Ca +和和Mg+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180200bp核小體核小體DNA多聚體。多聚體。DNA雙雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列鏈斷

56、裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的的3-OH末端可在脫末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的的3-末端，末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有沒(méi)有DNA

57、的斷裂，因而沒(méi)有的斷裂，因而沒(méi)有3-OH形成，很少能夠被染色。形成，很少能夠被染色。 流式細(xì)胞儀最初的應(yīng)用之一便是檢測(cè)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀最初的應(yīng)用之一便是檢測(cè)細(xì)胞的DNADNA含量，它含量，它可快速將細(xì)胞循環(huán)中的其它階段與有絲分裂期區(qū)別開(kāi)來(lái)。這可快速將細(xì)胞循環(huán)中的其它階段與有絲分裂期區(qū)別開(kāi)來(lái)。這些檢測(cè)是基于對(duì)細(xì)胞內(nèi)些檢測(cè)是基于對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNADNA以化學(xué)定量方式的染色（染料著色以化學(xué)定量方式的染色（染料著色數(shù)量直接與細(xì)胞內(nèi)數(shù)量直接與細(xì)胞內(nèi)DNADNA含量相關(guān)）。有相當(dāng)多的對(duì)含量相關(guān)）。有相當(dāng)多的對(duì)DNADNA有有高親合力的染料可用于此應(yīng)用。而不同的染料與高親合力的染料可用于此應(yīng)用。而不同的染料與D

58、NADNA分子結(jié)分子結(jié)合的位點(diǎn)不同。合的位點(diǎn)不同。 當(dāng)運(yùn)用當(dāng)運(yùn)用DNADNA結(jié)合熒光染料后，經(jīng)流式分析可觀察到一個(gè)有結(jié)合熒光染料后，經(jīng)流式分析可觀察到一個(gè)有特征的圖譜，那就是由各種細(xì)胞組成的一個(gè)細(xì)胞周期分布圖。特征的圖譜，那就是由各種細(xì)胞組成的一個(gè)細(xì)胞周期分布圖。細(xì)胞周期細(xì)胞周期0 200 400 600 8001000DNA含量含量細(xì)細(xì)胞胞數(shù)數(shù)量量細(xì)胞周期中各個(gè)環(huán)節(jié)在流式細(xì)胞儀上分析時(shí)的圖譜特征細(xì)胞周期中各個(gè)環(huán)節(jié)在流式細(xì)胞儀上分析時(shí)的圖譜特征 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)PI染色進(jìn)行細(xì)胞周期分析的原理染色進(jìn)行細(xì)胞周期分析的原理 PI ,即碘化丙錠即碘化丙錠 ,可以與細(xì)胞內(nèi)可以與細(xì)胞內(nèi)DNA和和RNA

59、結(jié)合結(jié)合 ,采用采用RNA抑制劑將抑制劑將RNA消化后消化后 ,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA結(jié)合的結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細(xì)胞周含量的多少。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的期各時(shí)相的DNA含量不同含量不同 ,通常正常細(xì)胞的通常正常細(xì)胞的G1 /G0期具有二倍期具有二倍體細(xì)胞的體細(xì)胞的DNA含量含量 (2N) ,而而G2 /M期具有四倍體細(xì)胞的期具有四倍體細(xì)胞的DNA含含量量 (4N) ,而而S期的期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此含量介于二倍體和四倍體之間。因此 ,通通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)染

60、色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí) ,可以將可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1 /G0期期 ,S期和期和G2 /M期期 ,并可通過(guò)特殊并可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。值得注意的是軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。值得注意的是 ,PI不能通過(guò)細(xì)胞膜完不能通過(guò)細(xì)胞膜完整的細(xì)胞整的細(xì)胞當(dāng)細(xì)胞沒(méi)有進(jìn)入分裂過(guò)程時(shí)（我們機(jī)體中的絕大部分細(xì)胞），當(dāng)細(xì)胞沒(méi)有進(jìn)入分裂過(guò)程時(shí)（我們機(jī)體中的絕大部分細(xì)胞），它們處于細(xì)胞周期的它們處于細(xì)胞周期的G1G1期的位置上。因此期的位置上。因此G1G1細(xì)胞在數(shù)量上絕細(xì)胞在數(shù)量上絕對(duì)是居各期細(xì)胞之首并在流式圖譜上形成最高的信號(hào)峰。在對(duì)是居各期細(xì)胞之首并在流式