微小RNA及其在惡性淋巴增殖性疾病中作用的研究進(jìn)展

1、微小RNA及其在惡性淋巴增殖性疾病中作用的研究進(jìn)展     【摘要】  在動(dòng)植物基因組中廣泛存在一類(lèi)非編碼蛋白的RNA 基因，產(chǎn)生長(zhǎng)度大約為19-25 個(gè)核苷酸的RNA，它們被命名為微小RNA （microRNA，miRNA）。這是一類(lèi)具有調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)活性的小RNA。在生物的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本文對(duì)這類(lèi)基因的特征、生物學(xué)功能、產(chǎn)生與作用機(jī)制和在惡性淋巴增殖性疾病中作用的研究進(jìn)展作一綜述。 【關(guān)鍵詞】  miRNA；非編碼RNA；惡性淋巴增殖性疾病Progress on the Research of MicroRNA an

2、d Its Functions in Lymphoid MalignanciesReviewAbstract   Plant and animal genomes contain an abundance of small genes that produce RNAs of about 22 nucleotides in length，which was dubbed as microRNA （miRNA). These newly found endogenous RNAs may participate in a wide range of genetic regul

3、atory pathways and play an important role in the organism development . This paper  reviewed  the recent studies and progress on the characteristics，functions and mechanisms of the microRNAs，as well as the advances of research on lymphoid malignancies.Key words  miRNA; non-coding RNA

4、; lymphoid malignancies很多年來(lái)，DNA和蛋白質(zhì)一直是基因組研究中的主角，而RNA只是被看作來(lái)往于DNA和蛋白質(zhì)間的信使而已。最近，越來(lái)越多的證據(jù)已清楚地表明，RNA在幾乎所有動(dòng)植物物種中扮演的角色遠(yuǎn)比我們?cè)缦攘舷氲幕钴S。真核生物中存在兩種主要的非編碼RNA（non-coding RNA），并發(fā)揮著重要的作用。一類(lèi)為小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），另一為微小RNA（microRNA，miRNA）。miRNA是一種大小19-25 nt的單鏈小分子RNA，最早被確認(rèn)的miRNA是在線蟲(chóng)中的lin-4 （1993年）1和let-7（200

5、0年）2，3，它們參與調(diào)控線蟲(chóng)的發(fā)育時(shí)序（development timing），由于它們的長(zhǎng)度很短而且作用時(shí)間短暫，所以lin-4 和let-7一開(kāi)始被稱(chēng)為時(shí)間小RNA （small temporal RNA，stRNA）。后來(lái)隨著大量的miRNA被發(fā)現(xiàn)，對(duì)這些小分子RNA 的基因序列、加工表達(dá)方式、生理功能等方面研究表明，miRNA發(fā)揮著非常重要的、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，從一個(gè)全新的角度來(lái)認(rèn)識(shí)基因及其表達(dá)調(diào)節(jié)的本質(zhì)。2002 年美國(guó)科學(xué)雜志評(píng)出的年度十大科技突破中，miRNA 的發(fā)現(xiàn)名列榜首。到目前為止已報(bào)道了在人類(lèi)、果蠅、植物等多種生物物種中有將近1400個(gè)miRNA被報(bào)道。現(xiàn)在除了lin

6、-4 和let-7 外，其他miRNA統(tǒng)一用miR-#（#代表數(shù)字）表示，而相應(yīng)的編碼基因則用mir-#（#代表數(shù)字）表示。本文就miRNA特征和功能的研究進(jìn)展以及與惡性淋巴增殖性疾病的關(guān)系作一綜述。微小RNA的特征miRNA廣泛存在于真核生物中，與其他寡核苷酸相比，主要有以下特征。    （1）一般來(lái)源于染色體非編碼蛋白區(qū)的一段，本身不具有開(kāi)放讀框 （ORF） 及蛋白質(zhì)編碼基因的特點(diǎn)，現(xiàn)已鑒定的miRNA沒(méi)有一個(gè)與已知的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）匹配，說(shuō)明它們是由不同于mRNA的特殊轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)的4。    （2）成熟的miRNA長(zhǎng)度一

7、般為19-25 nt，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90 nt的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)切酶（RNA）Dicer酶加工后生成5，它們可以和上游或下游的序列不完全配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)參與了成熟miRNA的加工。    （3）成熟的miRNA 5 端有一磷酸基團(tuán)，3 端為羥基，定位于RNA前體的3 端或者5 端，且具有獨(dú)特的序列特征。其5端第一個(gè)堿基對(duì)U有強(qiáng)烈的傾向性，而對(duì)G卻有抗性，但第2-4個(gè)堿基缺乏U，一般來(lái)講，除第4個(gè)堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。    （4）miRNA基因不是隨機(jī)排列的，其中有一些成簇存在。多個(gè)miRNA

8、基因共同轉(zhuǎn)錄成一個(gè)前體RNA，然后成熟的miRNA從這個(gè)前體上加工而來(lái)6。來(lái)自同一個(gè)基因簇中的miRNA具有較強(qiáng)的同源性，而不同基因簇中的miRNA同源性較弱。例如線蟲(chóng)中一組高度相關(guān)的miRNA基因mir-35-mir-41，集中簇生在2號(hào)染色體的1 kb片段上，共同轉(zhuǎn)錄成1個(gè)前體miRNA，然后加工形成7個(gè)成熟的miRNA，在胚胎和成蟲(chóng)早期均高度表達(dá)，而在其他發(fā)育階段不表達(dá)。    （5）多數(shù)miRNA 的基因結(jié)構(gòu)和功能在進(jìn)化中呈現(xiàn)保守性，各種miRNA都能在其他種系中找到同源體。約12%的miRNA在線蟲(chóng)、果蠅、哺乳動(dòng)物和植物中呈現(xiàn)保守性，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些

9、保守片段中的堿基差異僅為1-2 nt。其中miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中高度保守。對(duì)miRNA的表達(dá)和進(jìn)化保守性的解釋是：為數(shù)眾多的miRNA構(gòu)成了調(diào)節(jié)性RNA家族，通過(guò)與mRNA內(nèi)的特定靶序列互補(bǔ)配對(duì)，參與這些基因的表達(dá)調(diào)控7。    （6）miRNA的表達(dá)具有階段特異性和組織特異性，即在生物發(fā)育的不同階段里有不同的miRNA表達(dá)，在不同組織中表達(dá)不同類(lèi)型的miRNA8。大多數(shù)miRNA的表達(dá)具有時(shí)序性，miR-3、miR-7基因只在果蠅胚胎形成時(shí)表達(dá)，而miR-1、miR-12的含量在果蠅幼蟲(chóng)階段急劇上升，并在成蟲(chóng)期維持較高水平

10、，同時(shí)在所有階段都存在的miR-9和miR-11的含量卻急劇減少9。小鼠胚胎中miR-1也呈階段性表達(dá)，只在胚胎形成的階段可以探測(cè)到其存在。miRNA的表達(dá)具有細(xì)胞和組織特異性，Bartel等10發(fā)現(xiàn)在已經(jīng)鑒定的16個(gè)miRNA中，有15個(gè)只在特定的植物組織中高水平表達(dá)。miR-1在人類(lèi)和成年鼠心肌組織中特異性表達(dá)，在其他組織中檢測(cè)不到；miR-17、miR-20位于HeLa細(xì)胞同一基因簇內(nèi)，并在斑馬魚(yú)細(xì)胞中表達(dá)，但在鼠腎和蛙卵巢細(xì)胞中未檢測(cè)到；miR-1和let-7都在成年果蠅中表達(dá)，而不在20-24小時(shí)的胚胎細(xì)胞中表達(dá)，在HeLa細(xì)胞中卻只測(cè)到let-7 miRNA。在不同的細(xì)胞和組織中不

11、同的發(fā)育時(shí)間中差異表達(dá)，顯示了它們?cè)诳刂苽€(gè)體發(fā)育中的特定功能。微小RNA的功能目前只有極少的miRNA功能被初步闡明，絕大部分miRNA的功能（特別是在哺乳動(dòng)物中）還不清楚。miRNA在生物的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中可能有以下重要的功能。個(gè)體發(fā)育的調(diào)控  在線蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程中l(wèi)in-4和let-7呈生長(zhǎng)階段的特異性表達(dá)，通過(guò)對(duì)mRNA序列特異的反義抑制，對(duì)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)不同發(fā)育階段的過(guò)渡進(jìn)行調(diào)控。lin-4控制幼體早期發(fā)育階段（幼蟲(chóng)1期到幼蟲(chóng)2期）的細(xì)胞分化，而let-7控制幼蟲(chóng)4期以后的階段到成體的轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)發(fā)育進(jìn)展。Gary等11曾報(bào)道缺乏或過(guò)度表達(dá)lin-4和let-7都會(huì)引起異時(shí)表型（異時(shí)是指

12、祖先和后代種類(lèi)在發(fā)育事件相應(yīng)時(shí)間上互不相同的情況），即改變了發(fā)育過(guò)程中速度調(diào)控的過(guò)程。在植物miRNA的研究中，發(fā)現(xiàn)植物心皮工廠（carpel factory，car）突變株中3個(gè)miRNA的表達(dá)水平顯著下降。植物心皮工廠是一個(gè)類(lèi)似切酶的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，這種缺陷是由于缺少miRNA加工而造成的10。參與細(xì)胞分化和組織發(fā)育  lin-4、let-7、mir-14、mir-23和矮腳雞（bantam)基因已被證實(shí)在細(xì)胞分化和組織發(fā)育中起重要作用12。Chen等13首次闡述了哺乳動(dòng)物中miRNA的功能，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體使miR-

13、181在鼠科動(dòng)物的造血祖細(xì)胞中異常地表達(dá)，然后用不同的條件處理這些細(xì)胞，分析B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞量加倍，而T淋巴細(xì)胞不受影響。這暗示miRNA可能在鼠類(lèi)和人的細(xì)胞發(fā)育分化中起著關(guān)鍵的作用。雙側(cè)不對(duì)稱(chēng)性（bilateral asymmetry）是很多生物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的正?，F(xiàn)象，然而對(duì)這種機(jī)制現(xiàn)在了解得還很少。Johnston等14發(fā)現(xiàn)，在線蟲(chóng)神經(jīng)細(xì)胞中有一種miRNA（此種miRNA的基因被稱(chēng)為lsy-6）控制著左/右神經(jīng)細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)基因表達(dá)（cog-1是1sy-6 miRNA 靶基因），這可部分解釋神經(jīng)系統(tǒng)功能的非對(duì)稱(chēng)性。調(diào)控基因的表達(dá)  人類(lèi)基因中有超過(guò)20

14、%的基因是由被miRNA所調(diào)節(jié)的15，一些miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)下調(diào)靶mRNA的表達(dá)16。對(duì)lin-4和let-7的研究表明，miRNA的主要功能是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（posttranscriptional regulation）。miRNA可以通過(guò)兩種機(jī)制中的一種調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，其中之一是結(jié)合到靶mRNA 3 UTR，抑制其翻譯；二是像siRNA作用一樣結(jié)合到靶上并降解靶mRNA17。miRNA可以作為觸發(fā)RNA干擾（RNAi）的分子18參與細(xì)胞增殖19、死亡20、細(xì)胞凋亡21和脂肪代謝22。miRNA還可能與轉(zhuǎn)座的抑制、基因重組有關(guān)，可能參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控，因此，認(rèn)為miRNA可

15、能和高等真核生物中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。miRNA 的加工機(jī)制和作用機(jī)制加工機(jī)制  據(jù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，miRNA的生成至少需要兩個(gè)步驟：第一步在細(xì)胞核內(nèi)，將長(zhǎng)的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）加工為70-90 nt的莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的前miRNA（pre-miRNA），執(zhí)行此過(guò)程的酶是RNase 家族中一員Drosha，其作為核心核酸酶執(zhí)行核內(nèi)miRNA前體加工的起始23，24；第二步在細(xì)胞質(zhì)中，將莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)前體加工為成熟的miRNA，執(zhí)行此過(guò)程的酶為RNase 超家族中另一員切酶（dicer），后者是一種ATP 依賴的核酸內(nèi)切酶。亞細(xì)胞定位研究證明，這兩個(gè)生物過(guò)程

16、分別局限于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，因此細(xì)胞中一定還存在一轉(zhuǎn)運(yùn)體系，將pre-miRNA從細(xì)胞核運(yùn)送至細(xì)胞質(zhì)。由此可見(jiàn)，miRNA的表達(dá)可從上述三個(gè)方面進(jìn)行調(diào)控25。    Pre-miRNA在被dicer/argonaute 復(fù)合物特異性識(shí)別，并剪切成22 nt左右的單鏈小RNA，miRNA是pre-miRNA莖中的一個(gè)臂。Dicer可以剪切pre-miRNA 5 端的一個(gè)臂，也可以剪切3 端的一個(gè)臂或者是同時(shí)剪切兩個(gè)臂7。Dicer及其同源物DCR-1是一類(lèi)多結(jié)構(gòu)域的RNase III樣蛋白，對(duì)雙鏈RNA或莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA進(jìn)行剪切，產(chǎn)生長(zhǎng)度約為22 nt、5 末端為單磷

17、酸基、3 末端為羥基的RNA產(chǎn)物26。作用機(jī)制  Ambros17研究發(fā)現(xiàn)lin-4和let-7與靶mRNA的3 UTR部分互補(bǔ)結(jié)合，從而抑制了蛋白質(zhì)的合成。在植物中研究發(fā)現(xiàn)miRNA和靶mRNA完全互補(bǔ)最終導(dǎo)致了靶mRNA的降解12。而在動(dòng)物中miRNA與靶mRNA通過(guò)不嚴(yán)格的堿基配對(duì)，抑制了mRNA的翻譯27，而此時(shí)并不誘導(dǎo)mRNA的降解。然而，有時(shí)情況并非完全如此：在動(dòng)物中，這種堿基是否嚴(yán)格配對(duì)將決定基因沉默方式，如果miRNA和靶mRNA完全互補(bǔ)它就能進(jìn)入RNAi途徑并且引導(dǎo)靶mRNA降解而不是抑制翻譯28。在擬南芥（arabidopsis）中即使miR-JAW和其靶序列不完

18、全配對(duì)，它也能夠通過(guò)降解mRNA來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子TCP家族的五個(gè)成員29，其具體機(jī)理目前還不清楚。miRNA與siRNA的聯(lián)系和區(qū)別從miRNA很容易聯(lián)想到另外一種外源性的RNA小分子小干擾RNA（siRNA）。miRNA與siRNA之間存在許多相同之處：在加工方面，siRNA與miRNA從雙鏈前體加工到成熟的22 nt左右的小分子RNA，都是dicer產(chǎn)物，因此具有dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)；在功能效應(yīng)方面，二者的生成都需argonaute家族蛋白的存在，同是RISC（RNA interference specificity complex，RISC）的組分，因此在siRNA和miRNA介導(dǎo)的沉默機(jī)制上有重疊。    但miRNA在以下幾個(gè)方面與siRNA不同：miRNA是細(xì)胞內(nèi)RNA的固有組分之一，而siRNA是在RNAi生成過(guò)程中形成的中間體，也即siRNA是在病毒感染或人工插入dsRNA后誘導(dǎo)而成的；dicer酶對(duì)兩類(lèi)RNA的加工過(guò)程不同，miRNA為不對(duì)稱(chēng)加工，僅來(lái)自含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)RNA前體的一側(cè)臂，剩余部分很快降解，而siRNA是對(duì)稱(chēng)來(lái)源于雙鏈RNA的