ITG誘導(dǎo)表達ppt課件

1、IPTG 誘導(dǎo)表達誘導(dǎo)表達原核基因的表達調(diào)控原核基因的表達調(diào)控 原核生物絕大多數(shù)基因按功能相關(guān)性成簇地原核生物絕大多數(shù)基因按功能相關(guān)性成簇地串聯(lián)、密集于染色體上，共同組成一個轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)、密集于染色體上，共同組成一個轉(zhuǎn)錄單位操縱子，如乳糖操縱子，如乳糖lac操縱子、阿拉伯糖操縱子、阿拉伯糖ara操縱子及色氨酸操縱子。操縱子機制在原操縱子及色氨酸操縱子。操縱子機制在原核基因調(diào)控中具有較普遍的意義。核基因調(diào)控中具有較普遍的意義。 乳糖操縱子元調(diào)節(jié)機制乳糖操縱子元調(diào)節(jié)機制 乳糖操縱子乳糖操縱子調(diào)控區(qū)調(diào)控區(qū)操縱序列操縱序列O啟動序列啟動序列P調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因I結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因Z 半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y

2、 透酶透酶A 乙酰基轉(zhuǎn)移酶乙?；D(zhuǎn)移酶 I PCAP Z Y X Z Y X I PCAP Z Y X I PCAP乳糖（-）乳糖（+）要要 點點 阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié) 真正的誘導(dǎo)劑是半乳糖 異丙基硫代半乳糖苷IPTG）pGEX-4T載體圖譜載體圖譜IPTG誘導(dǎo)表達實驗步驟誘導(dǎo)表達實驗步驟第一天第一天在超凈臺中將含有在超凈臺中將含有PGEX-4T-2空載體的甘油菌空載體的甘油菌5ul接接種在種在5ml的的LB培養(yǎng)液中，搖床過夜。培養(yǎng)液中，搖床過夜。第二天第二天將含有將含有PGEX-4T-2空載體的過夜菌按照空載體的過夜菌按照1:200比例接比例接種至種至100mlLB中，中， 37振蕩培養(yǎng)振蕩培

3、養(yǎng)2.5小時。小時。留取留取1.5ml菌液作為未誘導(dǎo)培養(yǎng)的對照。菌液作為未誘導(dǎo)培養(yǎng)的對照。在超凈臺中加入終濃度為在超凈臺中加入終濃度為0.4-1mM的的IPTG于于30誘誘導(dǎo)表達導(dǎo)表達3.5小時。小時。蛋白樣品制備蛋白樣品制備 取取1.5ml1.5ml誘導(dǎo)后菌液及誘導(dǎo)后菌液及預(yù)先準(zhǔn)備的未誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌預(yù)先準(zhǔn)備的未誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液離心，將沉淀部分加入相液離心，將沉淀部分加入相同體積的蒸餾水與上樣同體積的蒸餾水與上樣bufferbuffer，將蛋白樣品于沸水，將蛋白樣品于沸水中加熱中加熱1010分鐘，離心取上清分鐘，離心取上清進行進行SDS-PAGESDS-PAGE，檢測融合蛋，檢測融合蛋白的表達情況。白的表達情況。 RNA轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)區(qū)-10區(qū)區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N1