RT-PCR結(jié)合地高辛標(biāo)記定量檢測(cè)猴免疫缺陷病毒RNA

1、    RT-PCR 結(jié)合地高辛標(biāo)記定量檢測(cè) 猴免疫缺陷病毒 RNA        摘要：從感染猴免疫缺陷病毒(SIV)的恒河猴血漿和培養(yǎng)細(xì)胞株中分別純化病毒 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增SIV gag基因特異的 DNA 片段。將 RT-PCR 產(chǎn)物用地高辛標(biāo)記，檢測(cè)靈敏度比凝膠電泳和斑點(diǎn)雜交提高 100 倍。用已知拷貝數(shù)的 RNA 作為定量標(biāo)準(zhǔn)，可估計(jì)待測(cè)樣本中 SIV RNA 的拷貝數(shù)。主題詞：SIV/免疫學(xué)；聚合酶鏈反

2、應(yīng)；遺傳標(biāo)記；地高辛/診斷應(yīng)用中分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-3213(1999)01-0066-03Quantitative Detection of Simian Immunodeficiency Virus RNA by RT-PCR Combined with Digoxin LabelingCHEN Zheng-tu，ZENG Qing-ping，F(xiàn)U Lin-chun(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)Abstract:A simian immun

3、odeficiency virus(SIV)gag gene-specific DNA fragment was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)of RNA purified from the serum of SIV-infected marcaque monkey and a cultured cell line. The detection sensitivity of RT-PCR products by digoxin labeling was 100 folds as that

4、 by gel electrophoresis and dot blotting. The copy number of SIV RNA to be measured could be estimated by using a standard RNA whose copy number was known.Key words:SIV/immunology;POLYMERASE CHAIN REACTION;猴艾滋病模型1是當(dāng)今國(guó)際公認(rèn)的評(píng)價(jià)艾滋病治療藥物與疫苗療效及安全性的最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，俗有“黃金標(biāo)準(zhǔn)”(gold standard) 之稱2。對(duì)用藥后艾滋病模型猴外周血中猴免疫缺陷病毒(S

5、IV) RNA 的定時(shí)、定量、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)是正確評(píng)價(jià)藥物療效的重要環(huán)節(jié)之一，也是目前國(guó)際上公認(rèn)的病毒負(fù)荷檢測(cè)指標(biāo)。以往采用競(jìng)爭(zhēng)性聚合酶鏈反應(yīng)或逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (PCR/RT-PCR) 對(duì) DNA/RNA 進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，常因凝膠分辨力差或顯示信號(hào)不足而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降，有時(shí)還得出“假陰性”結(jié)果。為此，我們采用 RT-PCR 結(jié)合高效地高辛標(biāo)記的雙重放大技術(shù)檢測(cè) SIV RNA，檢測(cè)靈敏度大幅度提高，重復(fù)性好，適合進(jìn)行大樣本中 SIV RNA 的定量測(cè)定，為今后開發(fā)高效、實(shí)用的 DNA/RNA 定量檢測(cè)試劑盒打下了良好的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1SIV 核酸提取  感染 SIVmac2

6、51 的恒河猴血漿和感染 SIVmac 的CEMx174 細(xì)胞由本所吳小閑教授提供。采用德國(guó)寶靈曼公司病毒核酸提取試劑盒提取 SIV RNA/DNA，所用樣本量為 200 L，核酸提取產(chǎn)物定容為 50 L。1.2RT-PCR 擴(kuò)增SIV gag 上游引物為5AATGAGGAGGCTGCAGATTGGGACTTG3，下游引物為 5GCACTATCTTGCAATCTGGGTTAGC3，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所合成。擴(kuò)增反應(yīng)條件為 48 ，45 s，94 ，2 min，然后94 ，30 s，60 ，1 min，68 ，2 min，循環(huán) 40 次，最后 68 ，7min。所用標(biāo)本量為 2 L。標(biāo)

7、準(zhǔn) RNA 及其擴(kuò)增引物均購(gòu)自美國(guó)普羅麥格公司。采用英國(guó) UVP GDS-760 凝膠聯(lián)機(jī)成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。1.3地高辛標(biāo)記與斑點(diǎn)雜交采用德國(guó)寶靈曼公司的地高辛試劑盒及尼龍膜進(jìn)行標(biāo)記、雜交。1.4探針純化按美國(guó)普羅麥格公司 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明書操作。2結(jié)果2.1凝膠電泳檢測(cè)靈敏度將標(biāo)準(zhǔn) RNA 的RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)倍比稀釋后進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果只在稀釋 10 倍和 102 倍時(shí)檢出特異性擴(kuò)增帶(1)。    2倍稀釋液結(jié)果表明，凝膠電泳檢測(cè) RT-PCR 產(chǎn)物的分辨力較低，即使采用先進(jìn)的凝膠聯(lián)機(jī)成像系統(tǒng)，也只能檢測(cè)稀釋 102 倍的擴(kuò)增產(chǎn)物。

8、2.2地高辛標(biāo)記 RT-PCR 產(chǎn)物的顯色靈敏度在對(duì) 106 拷貝的標(biāo)準(zhǔn) RNA 進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增后，經(jīng)地高辛標(biāo)記、稀釋和顯色，結(jié)果如2所示。    234倍稀釋液結(jié)果表明，RT-PCR 擴(kuò)增后標(biāo)記產(chǎn)物稀釋 104 倍后仍能顯色，檢測(cè)靈敏度比凝膠電泳提高了 100 倍。根據(jù)起始拷貝數(shù)( 106拷貝)推算，可檢出的 RNA 為 102拷貝。將編號(hào)為 115 的猴血漿和感染 SIV 的 CEMx174 細(xì)胞的 RT-PCR 產(chǎn)物用地高辛標(biāo)記，純化后與標(biāo)準(zhǔn) RNA 的 RT-PCR 標(biāo)記產(chǎn)物共同顯色，結(jié)果從細(xì)胞和血漿標(biāo)本中分別可檢出稀釋 103 倍和

9、104 倍的 SIV RNA (3)。    234倍稀釋液以最低檢測(cè)閾值為 102拷貝計(jì)算，可反推出細(xì)胞和血漿標(biāo)本中所含 SIV RNA 分別為 10?5 拷貝 和106 拷貝。按濃縮比為 250 計(jì)算，兩樣本實(shí)際 SIV RNA 濃度分別為 2.5×107/ mL和 2.5×108/ mL。2.3RT-PCR 產(chǎn)物的斑點(diǎn)雜交用地高辛標(biāo)記的來(lái)自 CEMx174 細(xì)胞的 RT-PCR 產(chǎn)物作探針，分別與上述血漿和細(xì)胞來(lái)源的經(jīng)過(guò)倍比稀釋的 RT-PCR 產(chǎn)物雜交，結(jié)果如 4 所示。    6543

10、2拷貝由 4 可見，在 102 稀釋倍數(shù)以下雜交呈陽(yáng)性，而在 103 倍以上則呈陰性。由起始拷貝數(shù)可知，雜交只能檢測(cè)到 104 拷貝以上的 RNA。3討論血漿病毒 RNA水平是檢測(cè)體內(nèi)病毒負(fù)荷的常用手段，也是評(píng)價(jià)藥物療效的重要之一。然而，常用的核酸定量技術(shù)PCR/RT-PCR 一般采用凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)起始 RNA 以及隨后的擴(kuò)增產(chǎn)物濃度較低時(shí)，可能會(huì)因?yàn)槟z電泳的分辨力差而出現(xiàn)漏檢(假陰性)。因此，無(wú)論是采用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)還是電泳后進(jìn)行目測(cè)比較，檢測(cè)結(jié)果的分析都會(huì)受到凝膠分辨力的限制。為了有效地提高檢測(cè)水平，我們將 RT-PCR 產(chǎn)物用“高效引導(dǎo)”(high-prime) 地高辛標(biāo)

11、記和顯色系統(tǒng)加以檢測(cè)，結(jié)果在RT-PCR 產(chǎn)物稀釋 104 倍后仍能顯色，使檢出 RNA 的靈敏度從 104 拷貝提高到 102 拷貝，提高幅度高達(dá) 100 倍左右，接近質(zhì)控定量 PCR (QC-PCR) 的檢測(cè)水平 3。用已知拷貝數(shù)的 RNA 作為參比標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)平行的 RT-PCR 擴(kuò)增和擴(kuò)增后標(biāo)記及顯色，即可估計(jì)待測(cè)樣本中的 RNA 拷貝數(shù)。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)靈敏有效和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的 PCR/RT-PCR 定量檢測(cè)試劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)。另外 ，地高辛標(biāo)記比同位素標(biāo)記需時(shí)更短，操作更簡(jiǎn)單和更安全，二者的檢測(cè)靈敏度相近，故地高辛的應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越廣泛。鑒于斑點(diǎn)雜交的檢測(cè)水平與凝膠電泳相當(dāng)，故 RT-PCR 產(chǎn)物的定量不必采用操作較為復(fù)雜的分子雜交法。但是，在定量測(cè)定前先采用雜交法排除假陽(yáng)性，將能確保定量測(cè)定結(jié)果的可靠性?；痦?xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(39870725)和廣東省自然科學(xué)基金資助課題(980642)作者簡(jiǎn)介：陳征途，女，實(shí)驗(yàn)師；作者單位：陳征途（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）曾慶平（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）符林春（廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405）參考文獻(xiàn)：1盧耀增，吳小閑，涂新明，等.猴免疫缺陷病毒(SIV)猴模型的建