儀器分析 第三章高效液相色譜分析課件

1、高效液相色譜分析高效液相色譜分析基本要點(diǎn)：基本要點(diǎn)：1 1、了解高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)及適用范圍；、了解高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)及適用范圍；2 2、了解高效液相色譜儀的主要部件及高效液相色、了解高效液相色譜儀的主要部件及高效液相色譜法基本流程；譜法基本流程；3 3、理解常用檢測器的原理、適用的分析對象及適、理解常用檢測器的原理、適用的分析對象及適用范圍；用范圍；4 4、理解各種分離方式的原理及選擇原則。、理解各種分離方式的原理及選擇原則。第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 以高壓液體為流動相的液相色譜分析法稱高效液相色譜以高壓液體為流動相的液相色譜分析法稱高效液相色譜法（法（HPLC）。）。 液相色譜法開始階段

2、是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長（常有幾個(gè)小時(shí)）。柱效低、時(shí)間長（常有幾個(gè)小時(shí)）。HPLCHPLC是在經(jīng)典液相是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于色譜法的基礎(chǔ)上，于6060年代后期引入了氣相色譜理論而年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又

3、稱高壓液相色譜法。又因分析速度快壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法。又因分析速度快而稱為高效液相色譜法。而稱為高效液相色譜法。二、二、HPLC的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)1、HPLC特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1）高壓）高壓-壓力可達(dá)壓力可達(dá)150300Kg/cm2。色譜柱。色譜柱每米降壓為每米降壓為75Kg/cm2以上。以上。（2）高速）高速-流速為流速為0.110.0ml/min。（3）高效）高效-可達(dá)可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時(shí)塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)分離成份可達(dá)100種。種。（4）高靈敏度）高靈敏度-紫外檢測器靈敏度可達(dá)紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。同時(shí)消耗樣品少

4、。2、HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：（1 1）速度快）速度快- -通常分析一個(gè)樣品在通常分析一個(gè)樣品在151530min30min，有些樣，有些樣品甚至在品甚至在5min5min內(nèi)即可完成。內(nèi)即可完成。 （2 2）分辨率高）分辨率高- -可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。效果。 （3 3）靈敏度高）靈敏度高- -紫外檢測器可達(dá)紫外檢測器可達(dá)0.01ng0.01ng，熒光和電化學(xué)，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)檢測器可達(dá)0.1pg0.1pg。 （4 4）柱子可反復(fù)使用）柱子可反復(fù)使用- -用一根色譜柱可分離不同的化合用一根色譜

5、柱可分離不同的化合物。物。 （5 5）樣品量少，容易回收）樣品量少，容易回收- -樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。可以收集單一組分或做制備。三、三、HPLC與與GC比較比較 HPLC的保留值等色譜分析有關(guān)術(shù)語以及分配系數(shù)、分的保留值等色譜分析有關(guān)術(shù)語以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性以及所用基本理論（塔配比、塔板高度、分離度、選擇性以及所用基本理論（塔板理論與速率理論）與板理論與速率理論）與GC一致。但一致。但HPLCHPLC由于自身的一些由于自身的一些特點(diǎn)，與特點(diǎn)，與GCGC比還是有一定差別，主要有以下幾方面：比還是有一定差別，主要有

6、以下幾方面：1 1、應(yīng)用范圍不同、應(yīng)用范圍不同 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品；但適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品；但對高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣對高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品，尤其對大多數(shù)生化樣品不可檢測占有機(jī)物的品，尤其對大多數(shù)生化樣品不可檢測占有機(jī)物的20%20%。 HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有機(jī)介質(zhì)溶適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有機(jī)介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分子和離子型樣品均難氣化、熱穩(wěn)定

7、性差的生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測，用途廣泛，占有機(jī)物的可檢測，用途廣泛，占有機(jī)物的80%80%。 GC：流動相為惰性，氣體組分與流動相無親合作用力，流動相為惰性，氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相有相互作用。只與固定相有相互作用。2 2、流動相不同、流動相不同HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對分離起正向作用。且能提高柱的選擇性、改善分離度，對分離起正向作用。且流動相種類較多，選擇余地廣，改變流動相極性和流動相種類較多，選擇余地廣，改變流動相極性和pHpH值也值也對分離起到調(diào)控作用，當(dāng)選用

8、不同比例的兩種或兩種以上對分離起到調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相也可以增大分離選項(xiàng)擇性。液體作為流動相也可以增大分離選項(xiàng)擇性。3 3、操作條件不同、操作條件不同 GC：加溫操作。加溫操作。 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?。室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?。四四HPLC主要類型主要類型 通常將液相色譜法按分離機(jī)理分成吸附色譜法、分配通常將液相色譜法按分離機(jī)理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。其實(shí)，有些色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。其實(shí)，有些液相色譜方法并不能簡單地歸于這四類。液相色譜方法并不能簡單地歸于這四類。類類型型主要分

9、離機(jī)理主要分離機(jī)理主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附色譜吸附能，氫鍵吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜分配色譜疏水分配作用疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備凝膠色譜凝膠色譜溶質(zhì)分子大小溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜離子交換色譜庫侖力庫侖力無機(jī)離子、有機(jī)離子分析無機(jī)離子、有機(jī)離子分析手性色譜手性色譜立體效應(yīng)立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜親和色譜生化特異親和力生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析蛋白

10、、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析第二節(jié)第二節(jié) 影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分離的因素一、影響色譜峰形擴(kuò)展的各種因素一、影響色譜峰形擴(kuò)展的各種因素與與GC不同，不同，HPLC有其特點(diǎn)，因而其速率理論的表述方有其特點(diǎn)，因而其速率理論的表述方式也有區(qū)別：式也有區(qū)別：ELSMMSMHHHHHH渦流擴(kuò)散渦流擴(kuò)散傳質(zhì)阻力傳質(zhì)阻力固定相固定相流動流動流動流動相相滯留流動滯留流動相相分子擴(kuò)散分子擴(kuò)散GC:HOLC:CuuBAH1 1、渦流擴(kuò)散項(xiàng)、渦流擴(kuò)散項(xiàng)HEHE=A=2dp式中式中,為填充不均勻因子，當(dāng)固定相為為填充不均勻因子，當(dāng)固定相為4050m時(shí)時(shí),值為值為12；dp為填充固定相的平

11、均粒徑，顆粒小時(shí)，可降低為填充固定相的平均粒徑，顆粒小時(shí)，可降低A。2 2、分子擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散項(xiàng)HL2MLrDBHuu式中，式中，r為柱中填料間的彎曲因子為柱中填料間的彎曲因子(r0.6)；DM為溶質(zhì)在液體為溶質(zhì)在液體流動相中的擴(kuò)散系數(shù)流動相中的擴(kuò)散系數(shù)(DM10-5cm2/s)；u為液體流動相在填充為液體流動相在填充柱中的平均線速柱中的平均線速(cms)。 由于由于DM數(shù)值很小，因此數(shù)值很小，因此HL項(xiàng)對總板高的貢獻(xiàn)也很小，在項(xiàng)對總板高的貢獻(xiàn)也很小，在大多數(shù)情況下可假設(shè)大多數(shù)情況下可假設(shè)HL00。3 3、傳質(zhì)阻力項(xiàng)、傳質(zhì)阻力項(xiàng)C u可分為固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)可分為固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)Hs和流動相傳

12、質(zhì)阻力項(xiàng)。和流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng)。 （1 1） 固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)固定相傳質(zhì)阻力項(xiàng)Hs對液液色譜可表示為：對液液色譜可表示為：22(1)fSLdkHqukD式中：式中：q為常數(shù)為常數(shù)q =2/3=2/3（對均勻液膜，對大孔固定相（對均勻液膜，對大孔固定相 q =1/2=1/2，對球形非多孔固定相，對球形非多孔固定相q =1/30=1/30）；）；k為容量因子；為容量因子；df為固定液液膜厚度；為固定液液膜厚度；DL為溶質(zhì)在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)，為溶質(zhì)在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)，cm2/s；u為液體流動相在柱中的平均線速，為液體流動相在柱中的平均線速，cm/s。對液固色譜可表示為：對液固色譜可表示為：2222

13、1(1)SadkkHtutukk式中：式中：ta為樣品分子在液體流動相中的平均停留時(shí)間；為樣品分子在液體流動相中的平均停留時(shí)間；td為樣品分子被吸附在固定相表面的平均停留時(shí)間；為樣品分子被吸附在固定相表面的平均停留時(shí)間；k、u同前。同前。(2)(2)流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng)流動相傳質(zhì)阻力項(xiàng) 又分為移動流動相的傳質(zhì)阻力項(xiàng)又分為移動流動相的傳質(zhì)阻力項(xiàng)HMM和滯留流動相的傳和滯留流動相的傳質(zhì)阻力項(xiàng)質(zhì)阻力項(xiàng)HSM移動流動相的傳質(zhì)阻力對板高的貢獻(xiàn)可表示為：移動流動相的傳質(zhì)阻力對板高的貢獻(xiàn)可表示為：2pMMMdHuD 式中，式中，為色譜柱的填充因子，對短的、內(nèi)徑粗的柱子為色譜柱的填充因子，對短的、內(nèi)徑粗的柱子數(shù)值

14、較??；數(shù)值較?。籨p為固定相的平均粒徑；為固定相的平均粒徑；DM為溶質(zhì)在液體流為溶質(zhì)在液體流動相中的擴(kuò)散系數(shù)動相中的擴(kuò)散系數(shù)( (DM10-5cm2/s) )u同前。同前。滯留流動相的傳質(zhì)阻力對板高的貢獻(xiàn)可表示為：滯留流動相的傳質(zhì)阻力對板高的貢獻(xiàn)可表示為：2220(1)30(1)(1)pSMMdkHukrD式中，式中，為孔洞中滯留流動相在總流動相中占有的百分?jǐn)?shù)；為孔洞中滯留流動相在總流動相中占有的百分?jǐn)?shù)；r0 0為顆粒內(nèi)部孔洞的彎曲因子；為顆粒內(nèi)部孔洞的彎曲因子；k、dp、DM、u同前。同前。二、范第姆特方程的表達(dá)二、范第姆特方程的表達(dá)222222022(1)(1)30(1)(1)fpMpIM

15、pMddrDkHdquuukDDdkukrD 在高效液相色譜中，對液液分配色譜，范第姆特方程的在高效液相色譜中，對液液分配色譜，范第姆特方程的完整表達(dá)形式為：完整表達(dá)形式為：簡化表達(dá)式為：簡化表達(dá)式為：BHACuu三、方程的討論三、方程的討論HPLC與與GC的的H-u曲線比較：曲線比較： 1、在、在HPLC中，由于使用固定相中，由于使用固定相與流動相與與流動相與GC不同，不同，H-u曲線的曲線的最低點(diǎn)遠(yuǎn)低于最低點(diǎn)遠(yuǎn)低于GC。 2 2、HPLC中，流動相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)中，流動相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn) 4 4、由低的、由低的uopt值可看出值可看出H-u曲線具有平穩(wěn)的斜率，表明采曲線具有平穩(wěn)的斜率，表明采用高的液體流

16、動相流速時(shí)，色譜柱效無明顯的損失，這也用高的液體流動相流速時(shí)，色譜柱效無明顯的損失，這也是是HPLC的快速分離的基礎(chǔ)。的快速分離的基礎(chǔ)。 3 3、由低的、由低的Hmin值可看出，值可看出，HPLC色譜柱要比色譜柱要比GC填充柱有填充柱有更高的柱效。更高的柱效。高于氣相色譜，縱向擴(kuò)散對峰型的影響很小。高于氣相色譜，縱向擴(kuò)散對峰型的影響很小。B/uuDrdkkuDduDdkkqdHCuAHMpMpIfp0222222)1)(1 (30)1 ()1 (2 從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：分析，一般可采用以下措施：進(jìn)樣時(shí)間要短。

17、進(jìn)樣時(shí)間要短。填料粒度要小。填料粒度要小。改善傳質(zhì)過程。改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。適當(dāng)?shù)牧魉?。適當(dāng)?shù)牧魉佟Ｒ砸訦對對u作作圖，則有一最佳線速度圖，則有一最佳線速度uopt，在此線速度時(shí)，在此線速度時(shí)，H最小。一般最小。一般在液相色譜中，在液相色譜中，uopt很?。ù蠛苄。ù蠹s約0.030.1mm/s），在這樣），在這樣的線速度下分析樣品需要很長的線速度下分析樣品需要很長時(shí)間，一般來說都選在時(shí)間，一般來說都選在1mm/s的條件下操作。的條件下操作。較小的檢測器死體積。較小的檢測器死體積。第三節(jié)

18、第三節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀 典型的高效液相色譜儀是由典型的高效液相色譜儀是由高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)和和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（色譜工作站）（色譜工作站）五個(gè)基本部分和相關(guān)輔助部件構(gòu)成。五個(gè)基本部分和相關(guān)輔助部件構(gòu)成。一、一、 高壓輸液泵及梯度洗脫裝置高壓輸液泵及梯度洗脫裝置1 1、高壓輸液泵、高壓輸液泵 高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動相高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的

19、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。 基本要求：基本要求：流量穩(wěn)定，其流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)應(yīng)0.5%，這對定性定，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；流量準(zhǔn)確可調(diào)，量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；流量準(zhǔn)確可調(diào)，0.110ml/min，輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150300kg/cm2；液流穩(wěn)；液流穩(wěn)定，無脈動；定，無脈動；死體積小，要求小于死體積小，要求小于0.5ml。密封性能好，。密封性能好，耐腐蝕。耐腐蝕。 泵的使用及注意事項(xiàng)：泵的使用及注意事項(xiàng)： 防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m埃或其它任何防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和

20、單向閥，因此應(yīng)雜質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先過濾除去流動相中的任何固體微粒，泵的入口都應(yīng)連預(yù)先過濾除去流動相中的任何固體微粒，泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒。接砂濾棒。流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時(shí)間的情動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒

21、一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，用后必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于因此，用后必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（如對于反相鍵合硅膠色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（如對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇固定相，可以是甲醇或甲醇- -水）。水）。 2 2、梯度洗脫裝置、梯度洗脫裝置 梯度洗脫類似梯度洗脫類似GCGC的程序升溫。是使流動相中含有兩種的程序升溫。是使流動相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過程中連續(xù)或間斷改或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過程中連續(xù)或間斷改變流動相的組成，以調(diào)節(jié)它的極

22、性，使每個(gè)流出的組分都變流動相的組成，以調(diào)節(jié)它的極性，使每個(gè)流出的組分都有合適的容量因子，并使樣品中的所有組分可在最短的分有合適的容量因子，并使樣品中的所有組分可在最短的分析時(shí)間內(nèi)，以適用的分離度獲得圓滿的選擇性分離。析時(shí)間內(nèi)，以適用的分離度獲得圓滿的選擇性分離。 泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。液。 輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。則會使高壓密封環(huán)變形

23、，產(chǎn)生漏液。 流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。泵就無法正常工作。內(nèi)梯度：內(nèi)梯度：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。一定比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。外梯度：外梯度：一臺高壓泵，通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不一臺高壓泵，通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。 在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，

24、而且組成不斷在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視： 要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。小心。 梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的梯度洗脫

25、所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會被溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。 混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的

26、柱壓大約是甲醇或相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓水為流動相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進(jìn)行再生處理，使每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10301030倍柱容積的初始流動相流倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。二、進(jìn)樣裝置二、進(jìn)樣裝置 通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。通常使用耐高壓的六

27、通閥進(jìn)樣裝置。 六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種：六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種： 用部分裝液法用部分裝液法 進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%50%（最多（最多7575），并要），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。峰展寬。 用完全裝液法用完全裝液法 進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5 51010倍（最少倍（最少3 3倍），倍），這樣才能完全置換定量

28、環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。六通閥使用注意事項(xiàng)：六通閥使用注意事項(xiàng)： 樣品溶液進(jìn)樣前必須用樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45nm0.45nm濾膜過濾，以減少微濾膜過濾，以減少微粒對進(jìn)樣閥的磨損。粒對進(jìn)樣閥的磨損。 轉(zhuǎn)動閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則轉(zhuǎn)動閥芯時(shí)不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過高的壓力將使柱頭損壞再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí)，過高的壓力將使柱頭損壞。 為防止緩沖鹽和樣品殘

29、留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。溶劑沖洗，再用水沖洗。三、色譜柱三、色譜柱 色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。用條件有關(guān)。柱效以理論塔板數(shù)計(jì)，大約可達(dá)柱效以理論塔板數(shù)計(jì)，大約可達(dá)516萬萬/m。對于一般。對于一般的分析只需的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物

30、分析，只要塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，萬的柱子，因此一般因此一般1030cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。的需要。柱子內(nèi)徑一般為柱子內(nèi)徑一般為16mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為4.6或或3.9mm，長度為，長度為1530cm的直形不銹鋼柱。填料的直形不銹鋼柱。填料顆粒度顆粒度510m。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會降色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重

31、要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。溫度避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色

32、譜中，不應(yīng)應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。迅速降低柱效。 選擇使用適宜的流動相（尤其是選擇使用適宜的流動相（尤其是pHpH），以避免固定相），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)

33、合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠先被硅膠“飽和飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對流路系統(tǒng)中

34、流動相的置換應(yīng)以相混溶的在進(jìn)行清洗時(shí)，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的2020倍左倍左右，即常規(guī)分析需要右，即常規(guī)分析需要505075ml75ml。四、檢測器四、檢測器作用：用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的作用：用來連續(xù)監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。組成和含量變化的裝置。目前最常用的檢測器主要目前最常用的檢測器主要有：紫外紫外-可見檢測器可見檢測器熒光檢測器熒光檢測器示差折光檢測器示差折光檢測器電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器質(zhì)譜檢測器質(zhì)譜檢測器1 1、紫外吸收檢測器、紫外吸收檢測器 紫外吸

35、收檢測器是目前紫外吸收檢測器是目前HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測器。它中應(yīng)用最廣泛的檢測器。它靈敏度高，線性范圍寬，對流速和溫度變化不敏感，可用靈敏度高，線性范圍寬，對流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫，它要求被檢測樣品組分有紫外吸收，使用的于梯度洗脫，它要求被檢測樣品組分有紫外吸收，使用的洗脫液無紫外吸收或紫外吸收波長與被測組分紫外吸收波洗脫液無紫外吸收或紫外吸收波長與被測組分紫外吸收波長不同，在被測組分紫外吸收波長處沒有吸收。長不同，在被測組分紫外吸收波長處沒有吸收。光源光源檢測室檢測室光柵光柵二極管陣二極管陣列檢測器列檢測器2 2、熒光檢測器、熒光檢測器 是一種高靈敏度、有選擇是一種高靈敏

36、度、有選擇性的檢測器，可檢測能產(chǎn)生性的檢測器，可檢測能產(chǎn)生熒光的化合物。某些不發(fā)熒熒光的化合物。某些不發(fā)熒光的物質(zhì)可通過化學(xué)衍生化光的物質(zhì)可通過化學(xué)衍生化生成熒光衍生物，再進(jìn)行熒生成熒光衍生物，再進(jìn)行熒光檢測。其最小檢測濃度可光檢測。其最小檢測濃度可達(dá)達(dá)0.10.1ngml，適用于痕量，適用于痕量分析；一般情況下熒光檢測分析；一般情況下熒光檢測器的靈敏度比紫外檢測器約器的靈敏度比紫外檢測器約高高2 2個(gè)數(shù)量級，但其線性范個(gè)數(shù)量級，但其線性范圍不如紫外檢測器寬圍不如紫外檢測器寬。熒光檢測器結(jié)構(gòu)示意圖光源光源檢測器檢測器濾光片濾光片檢測室檢測室3.3.示差折光檢測器示差折光檢測器 是基于連續(xù)測定樣

37、品流路是基于連續(xù)測定樣品流路和參比流路之間折射率的變和參比流路之間折射率的變化來測定樣品含量的。光從化來測定樣品含量的。光從一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，一種介質(zhì)進(jìn)入另一種介質(zhì)時(shí)，由于兩種物質(zhì)的折射率不同由于兩種物質(zhì)的折射率不同就會產(chǎn)生折射。只要樣品組就會產(chǎn)生折射。只要樣品組分與流動相的折光指數(shù)不同，分與流動相的折光指數(shù)不同，就可被檢測，二者相差愈大，就可被檢測，二者相差愈大，靈敏度愈高，在一定濃度范靈敏度愈高，在一定濃度范圍內(nèi)檢測器的輸出與溶質(zhì)濃圍內(nèi)檢測器的輸出與溶質(zhì)濃度成正比。度成正比。 對所有溶質(zhì)都有響應(yīng)，某些不能用選擇性檢測器檢測的組對所有溶質(zhì)都有響應(yīng)，某些不能用選擇性檢測器檢測的組分，如

38、高分子化合物、糖類、脂肪烷烴等，可用示差檢測分，如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴等，可用示差檢測器檢測。器檢測。 電化學(xué)檢測器主要有安培、極譜、庫侖、電位、電導(dǎo)等電化學(xué)檢測器主要有安培、極譜、庫侖、電位、電導(dǎo)等檢測器，屬選擇性檢測器，可檢測具有電活性的化合物。檢測器，屬選擇性檢測器，可檢測具有電活性的化合物。目前它已在各種無機(jī)和有機(jī)陰陽離子、生物組織和體液的目前它已在各種無機(jī)和有機(jī)陰陽離子、生物組織和體液的代謝物、食品添加劑、環(huán)境污染物、生化制品、農(nóng)藥及醫(yī)代謝物、食品添加劑、環(huán)境污染物、生化制品、農(nóng)藥及醫(yī)藥等的測定中獲得了廣泛的應(yīng)用。其中，電導(dǎo)檢測器在離藥等的測定中獲得了廣泛的應(yīng)用。其中，電導(dǎo)檢

39、測器在離子色譜中應(yīng)用最多。子色譜中應(yīng)用最多。電導(dǎo)儀電導(dǎo)儀電極電極電電極極電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器4 4、電化學(xué)檢測器、電化學(xué)檢測器5 5、與檢測器有關(guān)的故障及其排除、與檢測器有關(guān)的故障及其排除 （1 1）流動池內(nèi)有氣泡）流動池內(nèi)有氣泡 如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大，如如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會在基線上出現(xiàn)許多線狀果氣泡較大，則會在基線上出現(xiàn)許多線狀 峰峰 ，這是由于，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對流動相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對流動相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加

40、大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增氣泡停留在流動池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時(shí)，用手指緊壓流動池出口，使池內(nèi)增壓，然輸液泵的同時(shí)，用手指緊壓流動池出口，使池內(nèi)增壓，然后放開。可反復(fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，后放開?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。以免流動池破裂。 （2 2）流動池被污染）流動池被污染 無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？?/p>

41、以使用適當(dāng)溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶漂移?？梢允褂眠m當(dāng)溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L1mol/L硝酸、水和硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。 （3 3）光源燈出現(xiàn)故障）光源燈出現(xiàn)故障 紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時(shí)需要更換光源燈。常峰，甚至使基線不有回零。

42、這時(shí)需要更換光源燈。 （4 4）倒峰）倒峰 倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于成正峰。用示差折光檢測器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于流動相的折光指數(shù)，也會出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動相的折光指數(shù)，也會出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測器時(shí)，無吸收的組分就會產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度測器時(shí)，無吸收的組分就會產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣的溶劑作流

43、動相。在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起時(shí)的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起的。的。 第三節(jié)第三節(jié)液相色譜分離原理液相色譜分離原理 高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。對色譜法及分子排阻色譜法。 1 1、液固色譜法、液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不

44、同而分離。分離過程是一個(gè)據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個(gè)吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，吸附解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度粒度5 50 0m。 適用于分離分子量適用于分離分子量20020010001000的組分，大多數(shù)用于非離的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。異構(gòu)體。2 2液液色譜法液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，體表面而形成的固定相，分離原理是根

45、據(jù)被分離的組分在分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個(gè)分分離過程是一個(gè)分配平衡過程。配平衡過程。 涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已

46、很少采用?，F(xiàn)在多式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如采用的是化學(xué)鍵合固定相，如C18C18、C8C8、氨基柱、氰基柱、氨基柱、氰基柱和苯基柱。和苯基柱。 液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法譜法(NPC)(NPC)和反相色譜法和反相色譜法(RPC)(RPC)。正相色譜法：正相色譜法： 采用極性固定相采用極性固定相( (如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相) )；流動；流動相為相對非極性的疏水性溶劑相為相對非極性的疏水性溶劑( (烷烴類如正已烷、環(huán)已烷烴類如正已烷、環(huán)已烷）

47、，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物合物( (如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。 反相色譜法：反相色譜法： 一般用非極性固定相（如一般用非極性固定相（如C C1818、C C8 8）；流動相為水或緩）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和

48、適用于分離非極性和極性較弱的化合物。極性較弱的化合物。RPCRPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLCHPLC應(yīng)用的應(yīng)用的80%80%左右。左右。 隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pHpH值。值。正相色譜法與反相色譜法比較正相色譜法與反相色譜法比較 正相色譜法正相色譜法 反相色譜

49、法反相色譜法 固定相極性固定相極性高中高中中低中低 流動相極性流動相極性低中低中中高中高 組分洗脫次序組分洗脫次序極性小先洗出極性小先洗出極性大先洗出極性大先洗出 從上面可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜從上面可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。3 3、離子交換色譜法、離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子

50、交換樹脂）。被（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。離。 緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動

51、相的基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動相的pHpH值和離子強(qiáng)度值和離子強(qiáng)度影響。影響。pHpH值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。 離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。核酸。4 4、離子對色譜法、離子對色譜法 是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合

52、物后，在非極性固定相中試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。 分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊分析堿性物質(zhì)常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對。 分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。四丁基銨磷酸鹽。 離子對色譜

53、法常用離子對色譜法常用C C1818，流動相為甲醇，流動相為甲醇- -水或乙腈水或乙腈- -水，水水，水中加入中加入3 310mmol/L10mmol/L的離子對試劑，在一定的的離子對試劑，在一定的pHpH值范值范圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測組分保留時(shí)間與離子對性質(zhì)、濃度、圍內(nèi)進(jìn)行分離。被測組分保留時(shí)間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其流動相組成及其pHpH值、離子強(qiáng)度有關(guān)值、離子強(qiáng)度有關(guān)。5 5、排阻色譜法、排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時(shí)間樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔

54、中，滯留時(shí)間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。第四節(jié)第四節(jié) HPLCHPLC固定相固定相 上節(jié)講了高效液相色譜法的主要類型及其分離原理，本上節(jié)講了高效液相色譜法的主要類型及其分離原理，本節(jié)介紹一下各種類型液相色譜所用的固定相。節(jié)介紹一下各種類型液相色譜所用的固定相。一、液一、液液色譜法

55、及離子對色譜法固定相液色譜法及離子對色譜法固定相 與與GLCGLC類似，類似，LLCLLC的固定相也是在擔(dān)體上涂漬一層固定的固定相也是在擔(dān)體上涂漬一層固定液構(gòu)成，或使用化學(xué)鍵合相。液構(gòu)成，或使用化學(xué)鍵合相。1 1、擔(dān)體、擔(dān)體 所用的擔(dān)體可分為如下幾類：所用的擔(dān)體可分為如下幾類： (1)(1)全多孔型擔(dān)體：全多孔型擔(dān)體： HPLC早期使用的擔(dān)體與早期使用的擔(dān)體與GC類似，是顆粒均勻的多孔類似，是顆粒均勻的多孔球體，如有氧化鋁、氧化硅、硅藻土等制成的球體，如有氧化鋁、氧化硅、硅藻土等制成的100100m全全多孔型擔(dān)體。多孔型擔(dān)體。其缺點(diǎn)是其缺點(diǎn)是： 填料的不規(guī)則性和較寬的粒度范圍會導(dǎo)致填充不易均勻

56、，填料的不規(guī)則性和較寬的粒度范圍會導(dǎo)致填充不易均勻，柱效低；填料孔徑分布不一，并存在柱效低；填料孔徑分布不一，并存在“裂隙裂隙”在填料深在填料深孔中形成滯留液體（液坑），溶質(zhì)分子在深孔中擴(kuò)散和孔中形成滯留液體（液坑），溶質(zhì)分子在深孔中擴(kuò)散和傳質(zhì)慢，使色譜峰變寬，柱效下降。傳質(zhì)慢，使色譜峰變寬，柱效下降。 HPLCHPLC在在2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代初開始使用年代初開始使用10m10m全多孔全多孔型擔(dān)體，它是由型擔(dān)體，它是由nmnm級的硅膠微粒堆積而成級的硅膠微粒堆積而成為為5m5m或稍或稍大的全多孔小球。大的全多孔小球。其優(yōu)點(diǎn)是：其優(yōu)點(diǎn)是： 顆粒小而均勻，傳質(zhì)快顆粒小而均勻，傳質(zhì)快（距離短

57、），柱效高。（距離短），柱效高。(2)(2)表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）：表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）： 它是直徑為它是直徑為303040m40m的實(shí)心核的實(shí)心核( (玻璃微珠玻璃微珠 ) )，表層上，表層上附有一層厚度約為附有一層厚度約為1 1 2m2m多孔表面多孔表面( (多孔硅膠多孔硅膠 ) )。其優(yōu)點(diǎn)是：其優(yōu)點(diǎn)是： 孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質(zhì)速度快，易孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質(zhì)速度快，易于填充均勻，柱效高。于填充均勻，柱效高。其缺點(diǎn)是：其缺點(diǎn)是： 柱子容量低、需要配用高靈敏檢測器。柱子容量低、需要配用高靈敏檢測器。 這種擔(dān)體目前應(yīng)這種擔(dān)體目前應(yīng)用較為普遍

58、。用較為普遍。 2 2、固定液、固定液 液液液色譜流動相和固定相都是液體，因此要求兩相要液色譜流動相和固定相都是液體，因此要求兩相要互不相溶。在液互不相溶。在液- -液色譜中常用的固定也只有極性不同的液色譜中常用的固定也只有極性不同的幾種，如幾種，如 ，-氧二丙腈、聚已二醇氧二丙腈、聚已二醇-400-400和角鯊?fù)榈取：徒酋復(fù)榈取? 3、化學(xué)鍵合固定相、化學(xué)鍵合固定相 將固定液機(jī)械的涂在擔(dān)體表面上構(gòu)成的這種固定相，在將固定液機(jī)械的涂在擔(dān)體表面上構(gòu)成的這種固定相，在實(shí)際使用時(shí)存在不少缺點(diǎn)，實(shí)際使用時(shí)存在不少缺點(diǎn)，2020世紀(jì)世紀(jì)6060年末發(fā)展起來了一年末發(fā)展起來了一種新型的固定相種新型的固定相

59、-化學(xué)鍵合固定相?；瘜W(xué)鍵合固定相。 即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵把有機(jī)分子結(jié)合到擔(dān)體表面。根據(jù)在硅膠表面表面。根據(jù)在硅膠表面( (具有具有SiSiOHOH基團(tuán)基團(tuán)) )的化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型(Si(SiOOC)C)；硅氧硅碳鍵型硅氧硅碳鍵型(Si(SiOOSiSiC)C)硅碳鍵型（硅碳鍵型（SiSiC C）和硅氮鍵型（和硅氮鍵型（SiSiN N）四種類型。）四種類型?；瘜W(xué)鍵合固定相具有如下一些特點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相具有如下一些特點(diǎn)：表面沒有液坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多；表面沒有液

60、坑，比一般液體固定相傳質(zhì)快得多；無固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命；無固定液流失，增加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命； 可以鍵合不同官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，應(yīng)用于多可以鍵合不同官能團(tuán)，能靈活地改變選擇性，應(yīng)用于多種色譜類型及樣品的分析；種色譜類型及樣品的分析；有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。收集。二、液固吸附色譜法固定相二、液固吸附色譜法固定相采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等，仍可采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等，仍可分為全多孔性和薄殼型兩種，其特點(diǎn)如前所述。分為全多孔性和薄殼型兩種，其特點(diǎn)如前所述