蛋白表達(dá)純化步驟(共5頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上一 證明目的蛋白有表達(dá)1 挑取一單菌落接種于含（AMP，終濃度為100g/ml）的3ml液體LB培養(yǎng)基中37，250rpm培養(yǎng)過夜。2 將過夜培養(yǎng)菌液以1:100轉(zhuǎn)接于含抗生素的100ml液體LB中，37，250rpm 3.5h（大量培養(yǎng)至OD600=0.6左右）3 取出1ml菌液為未誘導(dǎo)的電泳對照，剩余培養(yǎng)物加入IPTG至終濃度為1mmol/L。繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4h。4 以未誘導(dǎo)菌液與IPTG誘導(dǎo)后菌液做對比，SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖一1未誘導(dǎo) 2未誘導(dǎo) 3誘導(dǎo)后 4誘導(dǎo)后 二 表達(dá)的情況，是可溶還是沉淀1 將上述的37誘導(dǎo)的菌液離心（4，12000,5min），

2、棄上清（LB培養(yǎng)液），沉淀重懸于0.9% NaCl溶液洗菌。2 重懸于0.9% NaCl溶液的菌體離心，（4，12000,5min），棄上清（0.9% NaCl溶液），得菌體，稱菌體重量，懸于8ml PBS（PH7.0）緩沖液，緩沖液用量根據(jù)50100mg/ml的菌液終濃度。3 超聲波破菌：冰浴條件下，超聲波破碎大腸桿菌，超聲波設(shè)置如下：功率：400W 工作：15min 間隔：45s 全程時間：30min（30次左右）以菌液由白變透明，且不粘稠為依據(jù)（少量菌液用液氮反復(fù)凍融7次以上效果也不錯，而且簡單，但是DNA出來后會粘稠，可能加DNA酶會好些，那樣好離心，我是用接近最高轉(zhuǎn)速離心的（沒有加D

3、NA酶），不然分不開）4 將超聲波破碎的菌液離心（4，12000,5min），分別收集上清和沉淀，各取1ml，加入1ml 2×上樣緩沖液，沸水浴10min，SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖2三 探索可溶表達(dá)條件有上述結(jié)果可知，目標(biāo)蛋白在上清也有表達(dá)，即存在可溶性表達(dá)，但是量很少，大部分以包涵體的形式存在（沉淀中），而包涵體的存在也證明蛋白的表達(dá)量很高，上清可溶性蛋白的可操作性等因素的干擾優(yōu)于對包涵體蛋白的分離純化，所以可通過探索可溶性蛋白的表達(dá)條件，最終加大上清可溶性蛋白的含量，以便實現(xiàn)下一步實驗的進行。 影響包涵體形成的因素有很多，如誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時間，IPTG濃度，搖床轉(zhuǎn)速等等，所

4、以設(shè)置低IPTG濃度0.1mmol/L，在不同溫度，誘導(dǎo)時間上對照的表達(dá)對照：1）37，250rpm，5h2）30，180rpm，10h3）23，90rpm，30h過程：挑取一單一菌落接種于氨芐（Apm，終濃度為100g/ml）的3ml LB液體培養(yǎng)基中37，250rpm培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的菌液以1:100轉(zhuǎn)接于含上述抗生素的50ml+50ml+60ml液體LB中，37，250rpm，3.5h（大量培養(yǎng)OD600=0.6左右）。從60ml培養(yǎng)液中取10ml做未誘導(dǎo)對照，標(biāo)記3個50ml LB培養(yǎng)菌液：1）37，250rpm，5h 2）30，180rpm，10h 3）23，90rpm，30h

5、都分5次取樣：37每1小時取一次（取10ml）30每2小時取一次（取10ml）37每5小時取一次（取10ml）誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，將上述樣品分別破菌離心，得上清與沉淀，加2×上樣緩沖液，沸水浴10min，SDS-PAGE檢測。SDS-PAGE檢測：1 37 M1 2 3 4 5五樣的上清和沉淀2 30 M1 2 3 4 5五樣的上清和沉淀3 23 M1 2 3 4 5五樣的上清和沉淀4 不同溫度下最優(yōu)可溶性表達(dá)比較結(jié)果如下：由圖可知，23條件下，明顯提高上清目的蛋白的含量，并且，存在可溶性表達(dá)平衡，即20h以后，蛋白表達(dá)將以包涵體的形式存在，即無論如何改變條件，可溶性表達(dá)已到極限，所以無

6、需探索更低溫度等條件。四 大量制備，表達(dá)與純化配制1L LB液體培養(yǎng)基，分裝成100ml×10瓶，分別有利于大腸桿菌生長和后續(xù)操作。誘導(dǎo)培養(yǎng)：挑取：挑取一單一菌落接種于氨芐（Apm，終濃度為100g/ml）的3ml ×5管LB液體培養(yǎng)基中37，250rpm過夜，將過夜培養(yǎng)菌液以1:100轉(zhuǎn)接于含上述抗生素的100ml×10瓶液體LB中，37，250rpm，3.5h（大量培養(yǎng)至OD600=0.6左右），取出1ml菌液為未誘導(dǎo)的電泳對照，剩余培養(yǎng)物加入誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為0.1mmol/L，23，90rpm，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)20h。破菌收集上清：分別離心（4，1200

7、0,5min），加8ml×10管 PBS（PH7,0）緩沖液重懸后，冰浴條件下超聲波破碎（400W，15s，45s，30min）收集上清（8ml左右×10管）稀釋過濾上清：8ml左右×10管菌液用PBS（PH7.0）緩沖液稀釋為2倍，并過0.45nm濾膜，取1ml留樣過鎳柱純化（8ml左右×10管×2倍=160，分2次過柱，每次80ml）A 用緩沖液 I（PBS PH7.0緩沖液）再洗5個床體積，流速為2ml/minB 將稀釋過濾后的上清上樣，流速為1ml/minC用緩沖液 I（PBS PH7.0緩沖液）再洗5個床體積，流速為2ml/min，使目標(biāo)蛋白充分掛柱。D用50ml的咪唑的緩沖液III，洗去雜蛋白，流速為2ml/min，并收集洗雜峰E用50ml的咪唑的緩沖液III，流速為1ml/min，并收集洗脫峰，收集洗脫液F將收集洗脫液用1