間充質(zhì)干細胞在軟骨組織工程中的應(yīng)用

1、間充質(zhì)干細胞在軟骨組織工程中的應(yīng)用【摘要】 ：間充質(zhì)干細胞具有高度自我更新能力，能夠分化為各種類型的細胞。近20年間充質(zhì)細胞在軟骨組織工程中得到應(yīng)用，動物實驗顯示了良好的軟骨修復(fù)潛能，成為軟骨組織工程的理想的細胞來源。組織工程和干細胞技術(shù)已經(jīng)確定為對軟骨缺損有效的治療方法，間充質(zhì)干細胞有望在軟骨組織工程中得到更廣泛的應(yīng)用。本文對間充質(zhì)干細胞的特性和在組織工程中的應(yīng)用進行了綜述。 【關(guān)鍵詞】 間充質(zhì)干細胞骨性關(guān)節(jié)炎組織工程自體軟骨細胞移植術(shù)Abstract：Mesenchymal stem cells has an extensive proliferative potential and an

2、 ability to differentiate into various cell types.In recent years,masenchymal stem cells have been applied in cartilage tissue engineering and they have shown significant potenital for carriage repair in animal models,and are being used as an ideal cell source in cartilage tissue engineering.Tissue

3、engineering and stem cell technologies have established themselves as approved approaches for cartilage repair and eventually will be widely used in the clinical practive.This paper discusses the characteristics and the application of mesenchymal stem cells in cartilage tissue engineering. Key words

4、：mesenchymal stem cells; osteoarthritis; tissue engineering; autologous chondrocyte transplantation由于關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)能力有限，軟骨缺損的治療存在巨大挑戰(zhàn)。自體軟骨細胞移植術(shù)(autologous chondrocyte transplantation)是軟骨組織工程中的一種方法，目前治療軟骨缺損比較有效。軟骨組織工程最常應(yīng)用軟骨細胞，由于存在供區(qū)并發(fā)癥、軟骨細胞的去分化和生命周期有限等問題，近20年間充質(zhì)干細胞在結(jié)締組織工程中得到應(yīng)用，成為理想的細胞來源。間充質(zhì)細胞已經(jīng)在動物模型中顯示了良好的軟

5、骨修復(fù)潛能。1 自體軟骨細胞移植術(shù) 修復(fù)軟骨缺損有效的方法是自體軟骨細胞移植術(shù)(ACT)。這種手術(shù)方法于20世紀(jì)80年代由瑞典學(xué)者報道，用于治療骨性關(guān)節(jié)炎。應(yīng)用ACT治療的病人在全世界已經(jīng)超過20 000例。 Peterson等1隨訪39年的結(jié)果顯示病人的疼痛明顯減輕，切取的12個活檢標(biāo)本中有8個顯示透明軟骨特征，關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)達到持久的修復(fù)效果，如果2年后植入物不失敗，在38年的生存率接近100。 第2代自體軟骨細胞移植術(shù)應(yīng)用生物材料膜(例如雙層型膠原型膠原膜)代替骨膜瓣以固定填充缺損部位的軟骨細胞。目的是減少與使用骨膜瓣相關(guān)的骨膜反應(yīng)例如骨膜肥大。第3代軟骨細胞移植術(shù)是將軟骨細胞在三維支架環(huán)

6、境中培養(yǎng)，構(gòu)建成新的軟骨樣的組織后再移植修復(fù)軟骨。 應(yīng)用ACT面臨的主要問題包括供區(qū)部位的并發(fā)癥，軟骨細胞在體外擴增的去分化導(dǎo)致植入體內(nèi)后不能形成軟骨，纖維軟骨修復(fù)以及機械性能較差，關(guān)節(jié)的修復(fù)部位整合不良等2。 2 間充質(zhì)干細胞與組織工程 成功的組織工程包括3部份：（1）能夠提供合適的三維環(huán)境的支架；（2）能夠分化和保持特殊細胞表型的細胞；（3）添加合適的生物活性物質(zhì)如生長因子、細胞因子，作為細胞特異分化的合適的刺激。 軟骨組織工程面臨的主要問題是獲得有活力的和分化良好的軟骨細胞。間充質(zhì)干細胞有軟骨分化潛能，容易在體外大量獲取并擴增而不丟失分化能力，是軟骨再生的理想細胞來源。2.1 間充質(zhì)干細

7、胞的來源、分離和特性 間充質(zhì)干細胞來源于中胚層，具有高度自我更新能力，與造血干細胞不同，能夠分化為各種類型的細胞，包括骨細胞，脂肪細胞，軟骨細胞，肌細胞，心肌細胞和神經(jīng)元。它在保持骨髓的動態(tài)平衡和調(diào)節(jié)造血細胞系和非造血細胞系的成熟方面起著重要作用，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。從骨髓，臍帶血，脂肪組織和外周血中能夠分離出間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞占骨髓中有核細胞總數(shù)的2%3，容易從骨髓中分離出來，在體外擴增幾代而不丟失分化潛能3。間充質(zhì)干細胞的主要特征是在體外條件下貼附在塑料上，體外培養(yǎng)擴增呈成纖維細胞形態(tài)，表達幾種粘附分子，間充質(zhì)干細胞存在的標(biāo)記物包括CD105，CD 73，CD 90

8、，不表達CD 45，CD 34和其他造血干細胞標(biāo)記物3,4。臍帶血是間充質(zhì)干細胞的良好來源，臍帶血來源的間充質(zhì)干細胞能夠分化為多種類型細胞，例如內(nèi)皮細胞，神經(jīng)元，平滑肌細胞，脂肪細胞，成軟骨細胞和成骨細胞5。脂肪也是間充質(zhì)干細胞的豐富來源6，脂肪來源的間充質(zhì)干細胞在體外能夠分化為不同系的細胞，包括脂肪系，軟骨系，肌細胞系和成骨細胞系，與骨髓來源的間充質(zhì)干細胞相比成軟骨細胞的能力低7。Wagner等8應(yīng)用含有22種細胞表面抗原標(biāo)記物的儀器板的流式細胞計量術(shù)，發(fā)現(xiàn)從脂肪組織，臍帶血和骨髓中分離出來的間充質(zhì)干細胞的全部基因表達表型相同。用同樣的方法培養(yǎng)的來源于不同供體的間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生持續(xù)的和可重復(fù)

9、的基因表達。外周血分離出間充質(zhì)干細胞數(shù)量很低，很難誘導(dǎo)分化為軟骨細胞9。2.2 間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)在體外間充質(zhì)干細胞需要誘導(dǎo)才能分化為軟骨細胞。這種誘導(dǎo)包括添加許多不同的生長因子，分化因子，激素和細胞因子。主要的有轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-1，TGF-3)，胰島素樣生長因子(IGF-1)，地塞米松，骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族(BMPs)等。在軟骨細胞的軟骨分化過程中涉及激活的一個主要的信號傳導(dǎo)通路是裂原活化蛋白激酶(MAPKinase)通路，它能夠刺激形成特異性的軟骨形成轉(zhuǎn)錄因子Sox9，在軟骨細胞形成表型和功能方面起著重要作用。 間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化過程中的細胞內(nèi)的作用機制目前不是很清楚。Loui

10、se A10研究在單層塑料或3D膠原GAG支架中由TGF-1和IGF-1誘發(fā)的信號傳導(dǎo)通路，信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)成體鼠來源的間充質(zhì)干細胞向軟骨分化。結(jié)果表明在單層培養(yǎng)和在膠原GAG支架中的TGF-1誘導(dǎo)的軟骨分化中包括p38途徑，然而在單層培養(yǎng)中IGF-1誘導(dǎo)的軟骨分化累及p38，ERKl2和P13K。在IGF-1處理的間充質(zhì)干細胞的細胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)在P13K下游區(qū)的Akt(蘇氨酸激酶)磷酸化和磷酸-Akt累積。表明不同生長因子誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞向軟骨分化的信號傳導(dǎo)通路不同，但同種生長因子在二、三維環(huán)境中刺激分化時細胞內(nèi)的信號通路是相似的。 加入TGF-1的誘導(dǎo)軟骨分化可能通過smad3和-蛋白(-c

11、atenin)，以及Wnt信號通路來介導(dǎo)，提高間充質(zhì)干細胞的分化能力，同時抑制成脂肪和成骨11。使細胞分化成為軟骨系必須上調(diào)-catenin，然而對于成熟的成人軟骨細胞，-catenin能夠刺激軟骨細胞肥大和骨化。Hansoo Parka等13研究一個可注射的生物可降解的水凝膠復(fù)合物聚L-醇延胡索酸(OPF)，包含兔骨髓間充質(zhì)干細胞和明膠微粒，并帶有TGF-1。生物鑒定法顯示DNA數(shù)量在各組間沒有明顯的不同，然而與對照組相比微粒組糖胺聚糖有明顯的增加；軟骨特異性型膠原和蛋白聚糖基因的表達明顯增加并與TGF-1濃度呈劑量依賴性改變。表明兔間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)期是有活力的并分化為軟骨樣細胞。 Keu

12、n Hong Park等12將兔的間充質(zhì)干細胞種植在混合的水凝膠中，加入TGF-3或基本的成纖維細胞生長因子(bFGF)，判定生長因子對向軟骨分化的效果。在含有TGF-3的水凝膠支架內(nèi)，檢測全部的膠原和聚氨基葡糖含量最高，增殖率和產(chǎn)生軟骨特異性的細胞外基質(zhì)比bFGF組明顯增高。這表明加有TGF-3的細胞數(shù)量增加并保持細胞表型。 A.H.Huang等14確定負(fù)載軟骨細胞和間充質(zhì)干細胞的水凝膠構(gòu)建物在化學(xué)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)加入TGF-3時，能否達到正常的組織的抗張力性質(zhì)，細胞負(fù)載瓊脂糖水凝膠構(gòu)建物作分光特性并在化學(xué)的無血清培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。細胞濃集且拉伸率提高并且保持在300400 kPa的水平，最終的緊張

13、度和韌性增加，通過免疫組織化學(xué)染色方法型膠原沉積明顯增加。動物實驗已經(jīng)顯示TGF- 3能促進間充質(zhì)干細胞向軟骨分化21,23。 Lorenz U等15將人間充質(zhì)干細胞種植在可控制的釋放IGF-1絲纖蛋白(SF)支架內(nèi)，將支架放在含TGF-1補給性培養(yǎng)基內(nèi)。在支架內(nèi)第2周發(fā)現(xiàn)人間充質(zhì)干細胞的軟骨分化，第3周最明顯，在不負(fù)載的控制組支架內(nèi)沒有觀察到軟骨分化。表明IGF-1在多孔SF支架內(nèi)具有刺激人間充質(zhì)干細胞向軟骨分化的潛能。 地塞米松是一種合成的糖皮質(zhì)激素，能夠直接與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合誘導(dǎo)軟骨分化，是一種強有力的軟骨分化的刺激物，并且能夠加強TGF-的作用16。 BMPs屬于TGF-超家族，能誘

14、導(dǎo)軟骨形成，尤其是BMP-717，BMP-2、TGF-聯(lián)合應(yīng)用或者BMP-6和TGF-聯(lián)合應(yīng)用能夠促進軟骨分化。然而單獨使用BMP-2誘導(dǎo)成骨細胞形成17。BMP-2、TGF-合用通過Wnt信號傳導(dǎo)通路上調(diào)Wnt3a、-catenin，然后誘導(dǎo)產(chǎn)生Sox9和軟骨形成。Hanna Taipaleenmki等18通過抑制造血細胞生長，分離貼附的老鼠來源的間充質(zhì)干細胞，可以快速的去除CD34、CD45陽性表達細胞，以生產(chǎn)出短期選擇(STS)細胞。進一步傳代更富集的、更原始的、均一的Scal表達的長期的選擇(LTS)細胞。應(yīng)用幾種BMP誘導(dǎo)微球培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化。在STS細胞，軟骨分化進

15、展很快，在STS細胞rhBMP2和7支持快速的軟骨分化和終末分化，強于rhBMP6。在LTS細胞，rhBMP同源二聚體-2，-4，-6，和rhBMP異源二聚體27是有效的軟骨分化的強化因子，強于rhBMP5，7。2.3 構(gòu)建組織工程軟骨 間充質(zhì)細胞已經(jīng)與各種生物支架技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，在動物模型中顯示了良好的軟骨修復(fù)潛能。王文良等19以骨髓間充質(zhì)干細胞為種子細胞，運用纖維蛋白膠種植技術(shù)，以雙層殼聚糖(CS)羥基磷灰石(HA)復(fù)合支架為載體，修復(fù)兔骨軟骨缺損，結(jié)果顯示基本修復(fù)軟骨缺損，骨缺損有骨小梁長入，改良Wakitani評分優(yōu)于對照組。S.Lken等20從11個新西蘭大鼠的后側(cè)髂嵴獲取骨髓間充質(zhì)干

16、細胞，在自體血清中培養(yǎng)28 d并在移植前24 h轉(zhuǎn)移至透明質(zhì)烷支架內(nèi)。在雙側(cè)膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)髁制造4 mm直徑和1.5 mm深的缺損，在一側(cè)膝關(guān)節(jié)植入含有間充質(zhì)干細胞的支架，對側(cè)膝關(guān)節(jié)只植入支架。24周后處死兔子，組織學(xué)可以觀察到缺損處高度的填充，兩組間沒有明顯的不同，然而在間充質(zhì)干細胞處理組有更好的修復(fù)質(zhì)量的趨勢，沒有形成肥大細胞。Mrugala D等21從綿羊骨髓中分離間充質(zhì)干細胞，擴增，并鑒定，在后腿的髕骨內(nèi)側(cè)制造部分厚度的軟骨缺損，將間充質(zhì)干細胞種植在殼聚糖內(nèi)填充軟骨缺損，并加入TGF-3。在植入后2個月觀察到修復(fù)部位透明樣的軟骨樣基質(zhì)包繞軟骨樣的細胞，并于周圍軟骨整合在一起。Bernd

17、Wegener等22在成年羊的股骨髁負(fù)重部位制造關(guān)節(jié)軟骨缺損(直徑8 mm)，應(yīng)用微骨折術(shù)治療(n=6)，聚糖酯乳酸植入物治療(n=6)或聯(lián)合兩者治療(n=6)。12周后處死動物，檢測缺損由再生組織覆蓋的程度和用ODriscoll評分檢測再生的質(zhì)量。結(jié)果顯示聯(lián)合治療與單獨使用微骨折術(shù)相比能夠使再生物的質(zhì)量明顯提高。Seung Hwan Han等23應(yīng)用間充質(zhì)干細胞PLGA(聚乳糖酯酸復(fù)合物)支架，在移植前經(jīng)過TGF-3處理3周，然后把復(fù)合物移植到兔的股軟骨缺損處。在移植12周后，12只兔子中的10只顯示間充質(zhì)干細胞/PLGA支架復(fù)合物顯示軟骨再生。組織學(xué)檢查為透明樣的結(jié)構(gòu)，表達糖胺聚糖和2型膠

18、原。在統(tǒng)計學(xué)上組織學(xué)評分與正常的關(guān)節(jié)軟骨相同，表明使用間充質(zhì)干細胞/PLGA支架復(fù)合物并加入TGF-3能夠成功的再生關(guān)節(jié)軟骨，治療軟骨缺損。2.4 間充質(zhì)干細胞在臨床實驗中應(yīng)用 應(yīng)用間充質(zhì)干細胞治療人關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床實驗很少。Wakitani S等24對24例骨性關(guān)節(jié)炎病人進行臨床實驗。在這項研究中24個病人均接受脛骨高位截骨術(shù)，從12個病人的骨髓獲取自體間充質(zhì)干細胞，在單層培養(yǎng)中擴增并種植在型膠原膜上，植入軟骨缺損部位，12個病人作為對照組，接受不帶間充質(zhì)干細胞的植入物。在移植后42周，缺損部位由白色軟組織覆蓋，在樣本組織的幾乎所有部位觀察到甲苯胺藍染色，局部觀察到透明軟骨樣組織形成。雖然

19、臨床癥狀好轉(zhuǎn)沒有明顯的不同，細胞移植治療組與對照組相比，關(guān)節(jié)鏡和組織學(xué)等級評分更高。Wakitani S等25獲取病人自體骨髓間充質(zhì)干細胞，體外自體血清培養(yǎng)擴增，將其種植在膠原凝膠內(nèi)植入缺損部位，修復(fù)經(jīng)關(guān)節(jié)鏡證實的3個病人的髕股關(guān)節(jié)軟骨全層缺損，并用自體骨膜或滑膜覆蓋，在移植后6個月病人的癥狀明顯改善，并且保持1727個月。Kuroda R等26將自體間充質(zhì)干細胞種植在膠原支架內(nèi)，修復(fù)運動員的右膝內(nèi)側(cè)股骨髁的全層軟骨缺損，植入物用自體的骨膜瓣覆蓋，結(jié)果顯示術(shù)后1年病人的臨床癥狀明顯改善，恢復(fù)到先前的運動水平，沒有疼痛和其他合并癥。以上表明自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植是促進軟骨缺損修復(fù)的有效方法。2

20、.5 應(yīng)用間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程軟骨的困難 在軟骨組織工程中應(yīng)用間充質(zhì)干細胞的主要障礙是構(gòu)建的軟骨組織不夠成熟。在體外形成軟骨過程中，間充質(zhì)干細胞表達的透明軟骨特異性標(biāo)記物上調(diào)，型膠原和軟骨特異性蛋白如蛋白聚糖，但是肥大軟骨細胞的標(biāo)記物如X型膠原和堿性磷酸酶也上調(diào)。45的X型膠原由肥大軟骨細胞產(chǎn)生，被認(rèn)為是軟骨內(nèi)骨形成的一種重要的標(biāo)記物。Steck E等27在迷你豬的膝關(guān)節(jié)制造軟骨缺損，用膠原膜覆蓋，其中的一半接受自體間充質(zhì)干細胞移植在移植后8周，原位的環(huán)境觸發(fā)空間的有結(jié)構(gòu)的修復(fù)組織，上層纖維層，中間層軟骨形成，下層為肥大的分化細胞，并有一個趨勢更多的番紅0和型膠原陽性的細胞。與體外間充質(zhì)干

21、細胞向軟骨分化相比，體內(nèi)分化COL10A1COL2A1和MMP13COL2A1的比率明顯偏低。這表明與體外間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化相比，體內(nèi)的信號分子和生物力學(xué)刺激為祖細胞向膠原X陰性的軟骨細胞分化提供一個合適的環(huán)境。這表明間充質(zhì)干細胞在體外向軟骨細胞分化可能是不成熟的。 成人正常的關(guān)節(jié)表面淺層和中區(qū)的軟骨細胞堿性磷酸酶的活性很低，但堿性磷酸酶大量存在于鈣化區(qū)的肥大軟骨細胞內(nèi)、軟骨內(nèi)骨化中心和生長板內(nèi)，一般認(rèn)為堿性磷酸酶是成骨的典型標(biāo)記物。Hennig T等28將來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細胞(ATSC)球狀培養(yǎng)向軟骨細胞分化，結(jié)果顯示軟骨細胞顯示X型膠原沉積和ALP酶活性上調(diào)。 3 展 望

22、間充質(zhì)干細胞可以從許多組織中得到，最合適的來源是骨髓，臍血和脂肪組織。與軟骨細胞相比，它們的最大優(yōu)點是在培養(yǎng)中有更高的增殖潛能，能夠擴增得到組織工程軟骨所需的細胞。對于軟骨缺損的治療，間充質(zhì)干細胞是強有力的修復(fù)軟骨的工具。組織工程和干細胞技術(shù)已經(jīng)確定為有效的方法。需要深入研究間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的分化機制以及更詳細準(zhǔn)確的生物化學(xué)信號傳導(dǎo)通路，以及間充質(zhì)干細胞的生物學(xué)特性及其與三維支架的相互作用，以使分化的軟骨細胞接近正常軟骨細胞。這樣有望進一步制造出修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的更合適的生物材料，最終成功的修復(fù)和再生軟骨?！緟⒖嘉墨I】 1Peterson L，Brittberg M，Kivirant

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