第三章 色譜知識(shí)導(dǎo)論09-26

1、第三章 色譜知識(shí)導(dǎo)論色譜分析是從分離技術(shù)發(fā)展而成為分離-分析技術(shù)的一門綜合性學(xué)科，是一種物理化學(xué)的分析方法。它是將待分析的混合各組分在兩相中進(jìn)行分離，然后順序檢測(cè)各組分含量的方法。3.1色譜分析的歷史、定義及分類3.1.1歷史1906年，俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（M. Tswett）首先提出了色譜法，茨維特經(jīng)典實(shí)驗(yàn)如下：通過(guò)實(shí)驗(yàn)，茨維特成功的分離了樹葉的石油醚萃取液中的各種色素，得到了不同因素的譜帶。所得的譜帶中最下面的色譜帶呈黃色，經(jīng)分析為胡蘿卜素。隨后是另一黃色的葉黃素譜帶，上面兩層是呈棕色和黃綠色的葉綠素a、葉綠素b譜帶。由于不同色譜帶有不同的顏色，故此分離方法稱為色譜法色層法（chromat

2、ography）。雖然后來(lái)色譜的發(fā)展不限于分離有色物質(zhì)，更多用于無(wú)色物質(zhì)的分離及測(cè)定，由于習(xí)慣，現(xiàn)在仍沿用色譜這個(gè)名稱。在茨維特經(jīng)典實(shí)驗(yàn)里，溶于流動(dòng)相(石油醚)中的樣品(植物色素)各組分經(jīng)過(guò)固定相 (CaCO3)時(shí)，其與固定相發(fā)生吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等相互作用，且其作用的大小、強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致在固定相中滯留的時(shí)間也不同，從而先后從固定相中流出，實(shí)現(xiàn)了不同組分的分離。當(dāng)分離后的組分由流動(dòng)相攜帶進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)，就得到了一個(gè)一個(gè)的色譜峰。茨維特經(jīng)典色譜分離速度慢，分離效率低，一直沒(méi)有引起足夠的重視。1941年Martin和Synge把氨基酸的混合液注入到以硅膠做固定相的柱中，用氯仿做流動(dòng)相，

3、將各個(gè)氨基酸的組分分開，這才引起了化學(xué)家的重視。1944年Martin和Synge用濾紙代替硅膠，不用色譜柱，固定相是濾紙中含有水分的纖維素，流動(dòng)相用有機(jī)溶劑，也成功的分離了氨基酸，從而建立了紙色譜法(paper chromatography)。1952年，Martin等又提出了給揮發(fā)性化合物的分離測(cè)定帶來(lái)劃時(shí)代變革的氣相色譜法(gas chromatography)，因而獲得了當(dāng)年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。20世紀(jì)50年年代又出現(xiàn)了將固定相涂在玻璃板上的薄層色譜法（thin-layer chromatography）。現(xiàn)在，高效液相色譜及計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，使現(xiàn)代色譜進(jìn)入了一個(gè)迅速發(fā)展的新時(shí)代-智能色譜

4、（chromatography with artifical intelligence）。是色譜法在現(xiàn)代分離分析技術(shù)中占用極其重要的地位。3.1.2色譜的定義由茨維特經(jīng)典實(shí)驗(yàn)可知：色譜法是一種物理的分離方法。其利用固定相與被分離的各組分產(chǎn)生的吸附（或分配）作用的差別，被分離的各組分在固定相中的滯留時(shí)間不同，使不同的組分按一定的先后順序從固定相中被流動(dòng)相洗脫出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)不同組分的分離，再進(jìn)行定性定量分析。色譜分析操作時(shí)，不會(huì)損失混合物中的各個(gè)組分，不改變?cè)薪M分的存在形態(tài)，也不會(huì)生成新物質(zhì)。3.1.3色譜法的分類按兩相的狀態(tài)可分為：流動(dòng)相液體氣體固定相固體 液體固體 液體名稱液固色譜 液液色譜

5、氣固色譜 氣液色譜總稱液相色譜氣相色譜按固定相的性質(zhì)可分為：固定相性質(zhì)柱紙薄層板固定相形式填充柱開口管柱具有多孔和強(qiáng)滲透能力的濾紙或纖維素薄膜玻璃板在管內(nèi)填充固體吸附劑吸附在內(nèi)壁的毛細(xì)管操作方式從柱頭向柱尾連續(xù)沖洗從濾紙中央向四周擴(kuò)散從一端向另一端擴(kuò)散名稱柱色譜紙色譜薄層色譜按分離過(guò)程的物理化學(xué)原理分：名稱吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜原理利用吸附劑對(duì)不同組分吸附性能的差別利用固定液對(duì)不同組分分配性能的差別利用離子交換劑對(duì)不同離子親和能力的差別利用凝膠對(duì)不同組分分子的阻滯作用的差別平衡常數(shù)吸附系數(shù)KA分配系數(shù)KP選擇性系數(shù)KS滲透系數(shù)KPF流動(dòng)相為液體液固吸附色譜液液分配色譜液相離子交換

6、色譜液相凝膠色譜流動(dòng)相為氣體氣固吸附色譜氣液分配色譜3.2色譜圖及相關(guān)術(shù)語(yǔ)3.2.1色譜圖色譜圖是指色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或流動(dòng)相流出體積的曲線圖。3.2.2色譜相關(guān)術(shù)語(yǔ)基線：在實(shí)驗(yàn)操作條件下，只有純流動(dòng)相通過(guò)檢測(cè)器時(shí)記錄下的信號(hào)-時(shí)間曲線，它反應(yīng)了儀器噪聲隨時(shí)間的變化。穩(wěn)定的基線應(yīng)是一直線，若是斜線則稱為基線漂移，如基線上下波動(dòng)則稱為噪聲。 色譜峰色譜圖中曲線突起的部分稱為色譜峰，每個(gè)色譜峰代表樣品中的一種組分，理想的色譜峰應(yīng)為對(duì)稱的正態(tài)分布曲線。峰高和峰面積峰高h(yuǎn)：峰頂?shù)交€的距離。峰面積A：組分流出曲線與基線間所包圍的面積。峰拐點(diǎn)：二階導(dǎo)數(shù)為零的點(diǎn)。峰寬和半峰

7、寬峰寬Wb：兩側(cè)拐點(diǎn)處所做的切線與峰底相交兩點(diǎn)之間的距離。半峰寬：在峰高為h/2處的峰寬。保留值死時(shí)間tm：是不被固定相滯留組分（即惰性組分）從進(jìn)樣制出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)的時(shí)間，也是流動(dòng)相流過(guò)色譜系統(tǒng)所需的時(shí)間。死體積Vm：對(duì)應(yīng)于死時(shí)間所需的流動(dòng)相體積。Vm=tmFco Fco流動(dòng)相體積流速（mlmin-1）保留時(shí)間tR：組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)色譜峰頂點(diǎn)時(shí)所需的時(shí)間。保留體積VR：對(duì)應(yīng)于保留時(shí)間所消耗的流動(dòng)相體積。VR=tRFco調(diào)整保留時(shí)間tR：tR=tR-tm調(diào)整保留體積VR：VR=VR-Vm= tRFco-tmFco=（tR tm）Fco= tRFco相對(duì)保留值r21：r21= tR2/ tR1=

8、 VR2/ VR1。相對(duì)保留值越大，選擇性越好，越易分開。選擇因子：選擇前一個(gè)峰的調(diào)整保留值tRs為基準(zhǔn)，求其它后出峰組分i對(duì)基準(zhǔn)峰的香桂保留值。= tRi/ tRs= VRi/ VRs3.3色譜分析的基本理論3.3.1分配平衡分配系數(shù)K在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比。K=（溶質(zhì)在固定相的濃度）/（溶質(zhì)在流動(dòng)相的濃度）=Cs/Cm分配比k在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間的分配達(dá)平衡時(shí)的質(zhì)量之比。k=（溶質(zhì)在固定相的質(zhì)量）/（溶質(zhì)在流動(dòng)相的質(zhì)量）= ms/mm =（CsVs）/（CmVm）=KVs/Vm= K /= Vm / Vs稱為相率比，是柱

9、型特點(diǎn)參數(shù)。保留比Rs與分配比k的關(guān)系組分在柱內(nèi)的平均線速率uL與相同條件下流動(dòng)相在該柱內(nèi)的平均線速率的比值為保留比。Rs=uL/u， 而uL=柱長(zhǎng)/tR=L/tR ，u=柱長(zhǎng)/tm=L/tm故Rs= tm /tR用組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量分配比例系數(shù)表示時(shí)，保留比Rs為Rs=（組分在柱內(nèi)流動(dòng)相中的總質(zhì)量）/（組分在柱內(nèi)流動(dòng)相和固定相中的總質(zhì)量）= mm/( mm+ ms)=1/(1+k)可得出：tR= tm （1+k）分配比k，分配系數(shù)K與選擇因子的關(guān)系：= tR2/ tR1= VR2/ VR1= k2/ k1= K2/ K13.3.2色譜柱的總分離性能以上兩張譜圖k，, 值完全相同，僅僅由于柱

10、效高低不同使得它們具有不同的分離度。直觀的看，峰的尖銳程度代表了柱效高低，峰越尖銳，其柱效越高，通常使用理論塔板數(shù)（n）的大小衡量柱效的高低。色譜柱的總分離效能指標(biāo)分離度R。 分離度R越大，兩組分的分離程度越高。R=1.0時(shí)，分離效率達(dá)98%。R<1.0時(shí)兩峰部分重疊。R=1.5時(shí)，分離程度達(dá)99.7%。 R>1.5可以得到基線分離分離度R反映的是相鄰兩個(gè)峰的分開程度R太小，兩個(gè)峰無(wú)法徹底分離R太大，分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，工作效率低下一般要求R>1.5，也可遵循行業(yè)特殊規(guī)定3.4 色譜的定性、定量分析3.4.1色譜定性分析一般不能從色譜圖中給出定性結(jié)果，而需要與已知物對(duì)照，或利用色譜

11、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)或其它分析方法配合才能給出定性結(jié)果。利用已知物定性。利用已知物定性包含3個(gè)方面：用保留時(shí)間或保留體積定性；利用峰高增加法定性；利用雙柱或雙系統(tǒng)定性。與其它分析儀器結(jié)合定性。 實(shí)現(xiàn)聯(lián)機(jī)的條件有：樣品池體積足夠小，分析速度足夠快，分析的靈敏度足夠高，檢測(cè)限低。目前常見的色譜與其他分析儀器連接的技術(shù)主要有：色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，色譜-紅外光譜聯(lián)用。3.4.2色譜定量分析 色譜定量分析是基于被測(cè)物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有mi= fiAi，其中fi是絕對(duì)質(zhì)量校正因子，Ai是峰面積。定量要解決的問(wèn)題有：峰面積的測(cè)量和計(jì)算；校正因子的測(cè)量與計(jì)算；色譜定量方法及其應(yīng)用。校正歸一化法 歸一化法優(yōu)點(diǎn)：不必知道進(jìn)樣量；此法較準(zhǔn)確，儀