2.生物大分子分離純化技術(shù)1(精)

1、2第二章生物大分子分離純化技術(shù)生化楊質(zhì)分禽的特辣性：要求：分需方法簡便，選擇性好，效率壽，保持 生化楊質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型，分離方法盡量不影 響生化楊質(zhì)的生楊活性。由于生化煬質(zhì)一般都很脆弱，易受化學(xué)、場理因 素影響而變性，因而分需過程常要求在低濕.潔 凈、溫和的條件下進(jìn)行。本章所提到的生物大分子主要是指蛋自質(zhì)、酶 及核酸。4本章主要的內(nèi)彖包括:生化及臨床分析樣的預(yù)處理。生楊樣品的常規(guī)分離純化方法，如透析、微 過濾、冷凍干燥及禽心技術(shù)；生場大分子的赴泳分離純化技術(shù)；生楊大分子的色譜分需純化技術(shù)；2.1生化分析樣品的準(zhǔn)備與預(yù)處理生化樣品極其復(fù)雜，首先應(yīng)對(duì)所關(guān)心的待測楊 處于生場體的哪一個(gè)部住所荻得原

2、始的樣,并 對(duì)賣際分析之前應(yīng)進(jìn)行怠樣的處理必須有所了解。62.1樣醃的類型.采集及椽存 樣品的類型生化及臨床分析的樣品對(duì)象非常廣泛，分布于 動(dòng)楊或人體的每一個(gè)部住。它們可以是內(nèi)源性的 化合腸或外嫄性的化合暢。樣芫的基質(zhì)可以是簡 單的血樣.尿樣，也可以是比較復(fù)雜的糞便以至 整個(gè)組織。這些基質(zhì)非常復(fù)雜，常常由多相組成, 如血象和血細(xì)胞及多種分子量犬小不同的化合場。 彼分析對(duì)象的穩(wěn)走性也變化極丸，有只能穩(wěn)定存 益幾分鐘.對(duì)蛋匂酶極為敘感的肽類，也有幾乎 是完全穩(wěn)定的藥場的代謝物。樣品的采集對(duì)于給定的樣醃。采集處理速度與樣的代謝 活性與它們的化學(xué)和生化穩(wěn)定性密切相關(guān)。尿液中各種樣醃的濃度一般認(rèn)為可穩(wěn)走

3、幾小肘。 組織樣 般需要快遠(yuǎn)冷凍以防止發(fā)生變化，采 樣者應(yīng)該有相應(yīng)的樣采集及保存的設(shè)務(wù)。81.血樣成人平均含6L的血液、其中約55%的血漿和45%的細(xì)胞。血樣的采集一般采取清晨空販采 血，以避免飲食、運(yùn)動(dòng)、情緒等對(duì)血液成分的 彩響。動(dòng)物一般采取禁食1216h后采血，一 般生化檢臉?biāo)璧难簶?biāo)本采取費(fèi)脈抽血。7血樣有全血、血漿和血清之分。102.組織樣品組織樣通常采自肝、肌由、肺、骨髓或腸。這類組織是代謝活性的，因此采樣后幾費(fèi)之肉要牲液氮中或其它冷卻和中冷凍O樣品的毎存一般來說，任何生楊樣品釆集后都應(yīng)立即進(jìn)行分 析。但由于種種原因，這往往是不可能的。樣也 許需要運(yùn)送到賣殮室，也許完成一個(gè)研克需要

4、所有 的樣品同肘測定。任何在法律上有敗的分析必須注朗保存可期及保存條件等。液氮12生場體液中許多成分保存在室溫或4C下肘，由于 沉淀、蒸發(fā)、氧化或細(xì)菌的進(jìn)攻等原因，其濃度會(huì)發(fā) 生變化。對(duì)于血淸樣,若對(duì)其中的鈉或血請(qǐng)自蛋勺 進(jìn)行分析，多樣品保存在-20C對(duì)，20天內(nèi)不會(huì)發(fā)生 碉顯的變化。有些成分在保存期問確實(shí)可以發(fā)生朗顯 的變化，如兒黍酚胺,因此必須椽存于-20或-70C下， 必要肘可以加一些抗氧化利或酶抑制劑。讓血漿 或血請(qǐng)與紅血球接觸對(duì)，由于酶篙性的改變成彼分析 對(duì)象在細(xì)胞內(nèi)外分布的變化會(huì)使分析結(jié)果發(fā)生變化。 所以、一般要快速分禽成單一的相。11樣的初步處理盡管許多化合楊在全血漿中更為穩(wěn)定，

5、但另一 些，如氨基酸則應(yīng)保存柱不含妥自質(zhì)的溶液中。 許多樣分析之前都要求除去妥自質(zhì) 用于去除 蛋勺質(zhì)的各種沅淀方法的比較見表：14常用妥匂質(zhì)沉法方法的比較樣品沉淀制沉淀制與樣品的體枳分?jǐn)?shù)人 Ml 漿（除 99%的蛋白質(zhì)）三氯乙酸（10% W/V）*0-2二氯乙酸（6% W/W）0.7鶴酸鹽-硫酸0.7硝酸（5% W/V）3.0硫酸鋅-盤麵化頓2.0乙1.3丙酮1.4乙醇3.0甲酵4.()飽和硫酸鐵約 3.0超翦心約除 98%0 匸下加熱 10 mm約除 95 鳴紅細(xì)胞提取液（除 97%的蛋口質(zhì)）三氯乙酸（5% W/V）4.5三氯乙酸（10% W/V）3.X=氯乙酸（1,% W/V）3.3-w表

6、示質(zhì)童，v農(nóng)示體積.w/va示質(zhì)量怵積比。2.1.2礫樣品的準(zhǔn)備酶是一種具有催化活性的蛋自質(zhì)，它的催化活性 是其特征參數(shù)。任何分需純化步驟都應(yīng)考慮酶的生物 活性的保持問題。生理樣品中酶的絕對(duì)濃度的測走從原理上講是很簡 單的，分析肘的主要問題是純的酶標(biāo)樣的荻得。16酶在夭然界中總是存疫于很復(fù)雜的混合楊中， 通常一種細(xì)胞中可能含有成百上千種酶，為了了解 和分析一個(gè)復(fù)雜生理拝芫，如亞細(xì)胞麥、細(xì)胞或整 個(gè)組織中的酶，就必須將酶放農(nóng)一個(gè)盡可能簡單的 體糸中進(jìn)行研克。通過對(duì)單一酶的硏克可以獲得酶 對(duì)哪些底楊具有特異性、及應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及酶作 用方式。所有這些數(shù)據(jù)對(duì)于研丸酶在復(fù)雜體糸中的 坊能是非常重要的。

7、在許多匪學(xué)及工業(yè)應(yīng)用方 面.是否具有純的酶制劑非當(dāng)關(guān)鍵。15酶活性的夠持要獲得生理樣応酶坊 能研克的可靠 數(shù)據(jù) 必須對(duì) 酶進(jìn)行純化。雀.整個(gè)純化過程中如何保持酶的活 性是最關(guān)鍵的，細(xì)胞內(nèi)酶在分需純化過程中能抗 各種環(huán)境對(duì)酶活性的影響。但當(dāng)酶從天然的保護(hù)環(huán)境中釋枚出來后，它對(duì)每一步純化步驟都很敘感,細(xì)胞膜酶對(duì)嫁解尤其做感。18可滾性蛋自質(zhì)不論是存在于細(xì)胞質(zhì)的還是細(xì)胞 彖內(nèi)的，其蛋匂質(zhì)濃度從100 mg/ml到高達(dá)400 mg/ml（線卷體基質(zhì)內(nèi)）。體糸中存在各種天然的還 原和（如谷胱甘肽）使蛋匂質(zhì)保持高的還原電伐。其 它穩(wěn)定利也存在，如不同的底楊及產(chǎn)物。在蛋勺 質(zhì)純化過程中組織彼玻壞，蛋匂質(zhì)從它

8、們的保護(hù) 環(huán)境中釋放出來.彼限制在不同部住的蛋勺水解 酶也同時(shí)彼釋放出來。所以要對(duì)所關(guān)心的酶進(jìn)行 保護(hù)，以防止其彼氧化、水解或不可逆變性。通過控制純化過程中的pH、溫度及有機(jī)溶劑的 使用可以防止酶的變性。所使用緩沖溶液的pH應(yīng) 控制在68之間，并保持合適的需子強(qiáng)度使其可以 防止酶變性。檸純化過程的溫度吟低至15-25 C可 以使許多吟解過程減3-5o20酶在稀溶液中由于對(duì)甕皿壁或色譜填料的吸 附會(huì)引起變性。吸附使酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)解離而失 去活性，這種變性可以通過加入載體蛋勺來阻 止。比較需用的栽體蛋勺有牛血淸匂妥勺，或 商醃化的結(jié)構(gòu)簡單、分子量已知的合成蛋匂。我體蛋自選擇條件：1.與酶之間無相互作

9、用；2分子量與酶的分子量爰至少12得，以便必要對(duì) 可以很方便地用排阻色譜將二者分需。19一些特球的反應(yīng)令使催化活性部住的 活性喪 失一些。柱純化過程中一些輔助因子的失去會(huì)使 酶的活性喪夾，為此可以在純化緩沖液中加入輔 助因子。催 化活性 部住氨 基酸戎 基的共 價(jià)化學(xué) 修飾很 常見，最易彼修飾的氨基酸為半胱氨酸。R-SH+R-SHR-S-S-R22對(duì)蔬基氧化的防止：1. EDTA絡(luò)合全屬W子（非全屬酶）2.加入含琥基迖和，如琥基乙醇、2,3二蔬基丙醇. 蔬基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等對(duì)蛋自質(zhì)酶解的防止：蛋勺水解酶來自涪細(xì)胞的內(nèi)部， 哺乳動(dòng)場將其 包裝在溶酶體中，而在微生楊中.它們則存在于

10、質(zhì)膜和細(xì)胞壁之間。在用細(xì)胞勻漿法制備酶提取 物肘會(huì)發(fā)生蛋勺水解酶的猝放，所以對(duì)其活性要 進(jìn)行抑制。根據(jù)蛋勺水鮮酶的類型可以選用不同 的抑制劑O24常用蛋勺酶抑制劑1.氣代確酸二異丙酯(DEP)：可抑制絲氨酸蛋自酶,但在使用上DEP比較危險(xiǎn)，因?yàn)樗哂袠影l(fā) 性，并能進(jìn)攻人的乙酰膽喊酯酶而影響人的神經(jīng) 傳導(dǎo) C2.笨基甲基磺眺氟(PMSF)：非揮發(fā)性絲氣酸酶的 抑制劑，而且不與人的乙I膽喊酶作用。它還可 以抑制一些蔬基蛋匂酶及象酸肽酶。3.胃蛋自酶抑制素和甲(乙)酰-亮亮精三肽是酸 性蛋自水解酶類很強(qiáng)的抑制劑，彼抑制的酶有胃 蛋匂酶、組織蛋匂酶及酵母蛋勺酶A。23由于細(xì)胞質(zhì) 中含有當(dāng)達(dá)10% 15

11、%(W/V)的非 水成分，處在蛋勺質(zhì)周囲的水分子不能自由流動(dòng) 而使蛋匂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)加以穩(wěn)定。在酶提取楊制 備過程中為了模擬這種情況，通常加入非水的親 水分子：甘油或糖醇如葡萄糖、果糖、乳糖及山 梨糖醇。26在毎步純化之后都要進(jìn)行酶活性和妥勺質(zhì)量 的測走。在純化過程中酶的比活性(u/mg)逐漸增 加并最終達(dá)到最大。酶的粗提物要用硫酸鏤或聚 乙二醇(PEG)進(jìn)行分組泥淀加以濃縮，也可以用 色譜哌附，然后再迅速從色譜基質(zhì)上解壽下來。沉淀的蛋勺質(zhì)溶解癥小的體積中，這樣可由于濃 度高而JL穩(wěn)定。離心法(500050000 g)很適合于 亞細(xì)胞組分及硫酸鏤和PEG沅淀的酶的分禽。25生理樣品中具有生楊活性

12、礫的制備1酶活性測定過程確定生理樣芫中酶的活性一般都要經(jīng)過以下幾個(gè) 步驟：(1)酶及反應(yīng)液的制備，反應(yīng)液通常由一走濃度的 底楊組成，并有確走的溫度、pH及其它催化反應(yīng)所 需要的輔助因子；(2)檸酶加入反應(yīng)液或?qū)⒎磻?yīng)液加入到酶制劑中并 進(jìn)行溫育以引發(fā)反應(yīng)，隨后的測走都以引發(fā)反應(yīng)的 對(duì)間為起A；(3)反應(yīng)可以用不同的方式終止，最常用的方法是 使酶夾去活性；28(4)檸酶反應(yīng)產(chǎn)場從酶和底場中分需出來；(5)測走和鑒走在特走的肘間內(nèi)由酶反應(yīng)所生成的產(chǎn) 物；(6)在有 些情況下酶的活性可以用反應(yīng)速度法來測走;數(shù)據(jù)分析。272.樣品的制備方法對(duì)所有的生場樣品(組織、尿液.脳脊髓液及細(xì)胞 培養(yǎng)液等)柱分析之

13、蔚都要進(jìn)行下述準(zhǔn)備工作；(1)研兗對(duì)象的準(zhǔn)備(如動(dòng)楊)；(2)標(biāo)本的采集；(3)由標(biāo)本制備樣;(4)標(biāo)本或樣的形態(tài)；(5)標(biāo)本或樣品的保存；(6)用于酶法分析樣品的預(yù)處理；(7)標(biāo)本是來自于研克對(duì)象的一部分，并作為研克的 代表。30從生理樣芫制備具有生楊涪性的酶肘，主要應(yīng)考 慮兩種因素：1.選擇什么樣的生場樣芫作為進(jìn)行純化的起始原料。 如：令有麥骨、組織、生楊液.微生楊細(xì)胞及從培 養(yǎng)液或發(fā)酵液中獲得的單細(xì)胞生楊等；分需開的各 種細(xì)胞混合楊，經(jīng)嫁鮮所猝扳出來的 亞細(xì)胞碎片， 它們 包括像線粒體類的 細(xì)胞麥及膜組 分或含可溶性 成分。對(duì)這類樣品進(jìn)行處理的第一步是不同細(xì)胞彖 的分禽及可溶楊與不溶楊的

14、分需，然后對(duì)膜成分進(jìn) 行溶解，最后將不同種類的分子加以分需。292.樣縣應(yīng)純化到什么程度。傳統(tǒng)的純化法最終所得到的是均勻的蛋自質(zhì)溶 液。樣醃純化的主要目的是能夠分析單一的酶活 性而不受其它物質(zhì)的干擾。但對(duì)有些研兗，其它 有活性成分的存在則是有利的或必要的。32(1)從組織或甕官制等樣組織和彖官至少可以分為兩部分，即細(xì)胞和細(xì)胞 內(nèi) 成分。所感興趣的成分可能存在于 上述兩個(gè)部分 中的任何一個(gè)。將整個(gè)未損傷的細(xì)胞從穩(wěn)定的小纖 維基質(zhì)中分離出來要采用細(xì)胞篩選技術(shù)。通當(dāng)所使 用的用于基質(zhì)玻碎的方法(如切、剪、松碎)會(huì)迭成 一些細(xì)胞的玻碎，而利 用純化的酶可以對(duì)基質(zhì)進(jìn)行 特辣方式的4如膠原酶可用來玻碎哺乳

15、動(dòng)楊組 織。使用胰蛋勺酶及其它蛋勺水解酶也取得了 一定 的成功，這拝的方法所得到的是細(xì)胞的混合場，細(xì) 胞內(nèi)成分中也包括了一些不溶性的碎片及加入的酶 和試劑。(2)從組織或器官培養(yǎng)液中制務(wù)樣品經(jīng)培養(yǎng)的樣品通?？砂搭愃朴谏厦娴姆椒ㄟM(jìn)行。 值得注意的是要逹免由于外加的細(xì)胞內(nèi)成分及培 養(yǎng)介質(zhì)所產(chǎn)生的影響。因?yàn)樗鼈冎锌赡芎衼碜?于介質(zhì)本身或在樣品培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生的具有酶 活性的楊質(zhì)。34(3)從細(xì)胞培養(yǎng)液制備樣品對(duì)在培養(yǎng)液中生長的哺乳動(dòng)楊細(xì)胞或細(xì)苗等樣 % ,在分析之前要將非細(xì)胞成分與細(xì)胞成分分開，細(xì)胞與培養(yǎng)液.的分禽采用低速禽心就可以賣現(xiàn)，上請(qǐng)液要進(jìn)行酶活性分析，濾餅留下來用于溶解 和分析 o總之，

16、酶樣応的制備區(qū)別于其它的生場丸分子， 其預(yù)處理過程相對(duì)較復(fù)雜，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求嚴(yán) 格進(jìn)行每步操作。332.2生楊樣醃的常規(guī)分富純化方法2.2.1透析(Dialysis)透析是用于生楊大分子分離和純化的一種簡單而古 老的方法， 它是在滲透中既有溶劑流動(dòng)又有滾質(zhì)流 動(dòng)的過程。操作：把待分需或純化的樣芫封入由半透膜組.成的 透析袋內(nèi)，然后將袋子放入低禽子強(qiáng)度的透析液中 進(jìn)行透析。根據(jù)半透膜規(guī)格的不同，只有膜內(nèi)分子 量小于分子量阻截范囲的分子才可以透過膜進(jìn)入透 析液中，從而賣現(xiàn)大分子與小分子的分壽或生楊大 分子的純化36操作要點(diǎn)：為了加速透析的進(jìn)程，一般莊透析的過程 中要進(jìn)行連續(xù)攪拌，同對(duì)在透析篆內(nèi)霧

17、下大約 透析裊總體積10%的空陳，以便使得迓析膜界 面兩側(cè)能逐過膜的分子滾度梯度加大。逸析平 衡的肘間一般為46小時(shí)，進(jìn)一步透析需要換 液?？紤]到彼透析的生楊分子較壽濕度下易變 性，透析一般在34。（：下進(jìn)行。35透析膜常用的透析膜材料有犬棉膠、玫病紈以及纖維 素等。膜孔徑的丸小可以有不同的規(guī)格，在醫(yī)藥 工業(yè)中常使用纖維素透析管，其分子量阻帆范囲 為1.0 x103-5.0 x104o38凌析管的選擇：主要考慮分子董阻截范圏其次考慮管的尺寸37透析管的預(yù)處理透析管使用之前一般要進(jìn)行運(yùn)多的處理，以除 去諸如甘油、重全屬需子、含硫污染楊及可能存 在的蛋匂或核酸水解酶類。40透析液最常用的透析液是水

18、，一定pH和離子強(qiáng)度的緩 沖液或壽分子惰性楊質(zhì)的濃溶液。柱純的水中透 析一般速度比較快.但有逢成生楊楊質(zhì)活性喪失 的危險(xiǎn)。所以，通常選擇具有一定pH和禽子強(qiáng)度 的緩沖液作為透析液.有肘也可以選擇壽分子惰 性物質(zhì)的濃嫁液，因?yàn)閴鄯肿硬粫?huì)進(jìn)入膜內(nèi)而 水分子可以自由出入膜孔。柱這種情況下，除了 正活的透析之外，由于膜內(nèi)外激透壓差的存在， 膜內(nèi)JL多的水會(huì)逐析到膜外，直到內(nèi)外滲逐壓達(dá) 到平衡為止，因而，也具有濃縮樣芫的功能,39it析的應(yīng)用透析的主要用途是從生楊丸分子樣中除去鹽類或 其它小分子場質(zhì)。1.在分需及純化蛋勺質(zhì)及菌肘經(jīng)常要加入有機(jī)溶 劑 或無機(jī)鹽類，如硫酸段或硫酸鈉以沉淀蛋勺質(zhì) 類生場大分于，由于生楊大分孑征沉淀的同肘會(huì) 不可避免地混雜有這些小分子，從而干擾生場大 分子的進(jìn)一步純化或性質(zhì)鑒;t。透析法是除去這 些小分子的簡便而有效的方法。42it析的應(yīng)用2.用來除去與生場大分子結(jié)合較弱的小分子或禽子, 如全屬禽子及酶的輔助因子NAD, FAD等