藥品微生物限度檢查方法驗(yàn)證步驟及示教

1、藥品微生物限度檢查方法驗(yàn)證一般步驟1.樣品及確定驗(yàn)證項目 樣品要求：不含菌或少量菌 驗(yàn)證項目：根據(jù)藥品用藥途徑、處方、制法確定。細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗(yàn)證（一般必作）；控制菌檢查如為中藥制劑必須查標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)用藥途徑、處方、制法確定控制菌檢查項目。特殊的如滴眼劑、用于燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷等應(yīng)根據(jù)制劑通則項下要求及微生物限度標(biāo)準(zhǔn)來確定。 2. 確定供試液制備方法 3. 方法選擇預(yù)試驗(yàn) （1）目的：確定樣品對試驗(yàn)菌有無抑菌活性及計數(shù)驗(yàn)證各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)方法。（2）查資料，根據(jù)樣品的功能、主治及所含成分等確定方法選擇預(yù)試驗(yàn)方案。 （3）根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定各試驗(yàn)菌計數(shù)驗(yàn)證方法 控制菌驗(yàn)證方法4. 驗(yàn)證試驗(yàn)：

2、選擇3個批號樣品進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，證明方法的有效性；5. 據(jù)驗(yàn)證結(jié)果優(yōu)化試驗(yàn)條件，建立微生物限度檢查方法SOP。6. 寫出驗(yàn)證資料。示教內(nèi)容11.5.上午：菌液制備方法： 一. 新鮮濃菌液制備（要求學(xué)員練習(xí)操作的內(nèi)容） 新鮮濃菌液接種：細(xì)菌 大腸埃希菌CMCC（B）44102 金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003 枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501 生孢梭菌CMCC（B）64941（厭氧梭菌） 銅綠假單胞菌CMCC（B）10104培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯3-5ml、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基3-5ml接種及培養(yǎng)：1.分別取各試驗(yàn)菌半個-1個菌落分別接種營養(yǎng)肉湯（充分研勻、搖勻），36±1培養(yǎng)1

3、6-18小時。 2.生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物取0.1ml接種硫乙醇酸鹽流體 培養(yǎng)基（臨用前排氧）36±1培養(yǎng)18-24小時。 霉菌及酵母菌 白色念珠菌CMCC（F）98001、 黑曲霉CMCC（F）98003培養(yǎng)基：改良馬丁培養(yǎng)基3-5ml；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面1. 取白色念珠菌的菌落接種改良馬丁培養(yǎng)基23-28培養(yǎng)24小時（可用36±1培養(yǎng)18-24）。2.黑曲霉孢子懸液的制備：沾取黑曲霉孢子接種改良馬丁瓊脂培養(yǎng)（紅字為示教內(nèi)容基，培養(yǎng)5-7天待培養(yǎng)物黑色孢子生長（全部變黑，已制備好斜面培養(yǎng)物示教）加入5-10ml0.9%氯化鈉溶液，小心振擋洗脫表面的黑色孢子1-2次，吸出洗

4、脫液（注意不要觸到菌絲體）即為孢子懸液。二.菌液稀釋計數(shù)方法細(xì)菌：大腸、金葡、枯草、銅綠 稀釋：營養(yǎng)肉湯作為稀釋劑, 按10-2、10-4、10-5、10-6稀釋級10-2 ： 取新鮮濃菌液0.1ml9.9ml充分打勻、10-4 ： 取10-2 0.1ml9.9ml充分打勻10-5 ： 取10-4 1ml9ml充分打勻，取0.2ml×2皿營養(yǎng)瓊脂計數(shù)10-6 ： 取10-51ml9ml充分打勻取0.2ml×2皿營養(yǎng)瓊脂計數(shù) 生孢梭菌（厭氧梭菌）：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基為稀釋劑按上述步驟稀釋至10-7。10-5、10-6、10-7、分別用50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基計數(shù)，各1-

5、2支。細(xì)菌計數(shù)：36±1培養(yǎng)24小時計數(shù)菌落數(shù)。 白色念珠菌： 0.9%氯化鈉溶液作為稀釋劑按上述步驟稀釋至10-5、10-6計數(shù)。 黑曲霉?jié)饩鷳乙海?0.9%氯化鈉溶液作為稀釋劑按上述步驟稀釋10-4、 10-5、10-6計數(shù)。25-28培養(yǎng)24-36小時計數(shù)菌落數(shù)。操作要點(diǎn) ：1. 新鮮濃菌液制備：挑取的菌落充分研勻并搖勻，注意各菌培養(yǎng)時間； 2. 稀釋菌液時每一步均應(yīng)充分搖勻；3. 枯草芽孢桿菌新鮮濃菌液會形成膜或沉淀，稀釋菌液時必須充分振搖后靜置，取其無塊狀物的菌液； 4. 黑曲霉接種時注意不能造成對接種環(huán)境的污染；點(diǎn)計菌落數(shù)時輕拿輕放以免造成計數(shù)誤差。11.5下午3. 微生

6、物限度檢查方法選擇預(yù)試驗(yàn) 根據(jù)樣品的溶解性、藥效、可能存在的抑菌性等確定預(yù)試驗(yàn)方法。計數(shù)（細(xì)菌、霉菌及酵母菌）驗(yàn)證一般選擇順序：平皿法、平皿稀釋法、中和法+平皿稀釋法、薄膜過濾法、離心500r/min3-5分鐘上清液+平皿稀釋法（細(xì)菌）、沉降+平皿稀釋法（霉菌），離心沉淀集菌法（3000r/min20分鐘）+平皿稀釋法、離心500r/min3-5分鐘上清液+薄膜過濾法（主要用于細(xì)菌計數(shù)驗(yàn)證）。方法應(yīng)在符合驗(yàn)證要求的前提下，考慮簡便可行。樣品：感冒清熱顆粒 方法：平皿稀釋法示教1. 供試液制備方法：樣品10g+稀釋劑90ml為1：10供試液。（最低稀釋級作為驗(yàn)證供試溶液）。2.計數(shù)驗(yàn)證回收試驗(yàn)：

7、 試驗(yàn)組（各1-2皿） 菌液組（各2皿）、 供試品對照組（各2皿）1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+大0.5ml） 大0.5ml 細(xì) 1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+金0.5ml） 金0.5ml 霉 1ml 0.5ml1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+枯0.5ml） 枯0.5ml 1ml 0.5ml （+白0.5ml） 白0.5ml 1ml 0.5ml （+黑0.5ml） 黑0.5ml （ 共55皿，按規(guī)定培養(yǎng)、計數(shù)菌落、計算回收率）3.根據(jù)回收試驗(yàn)結(jié)果確定敏感菌及各試驗(yàn)菌驗(yàn)證方法。操作要點(diǎn)： 1. 試驗(yàn)組：每皿加

8、入1：10供試液應(yīng)搖勻?yàn)榫鶆蚧鞈乙?、量要?zhǔn)確、刻度吸管吸取方法一致。平皿中1：10供試液與菌液盡可能不要接觸，立即傾注培養(yǎng)基并充分混合均勻。2. 計數(shù)驗(yàn)證加入50-100cfu試驗(yàn)菌，菌液的體積以0.4ml-0.6ml為宜；既試驗(yàn)菌液應(yīng)稀釋為100-200cfu/ml，放置2-8備用。11.6上午驗(yàn)證試驗(yàn)：選擇3個批號樣品進(jìn)行3次獨(dú)立驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證明方法的有效性；以敏感菌方法確定計數(shù)方法。樣品：感冒清熱顆粒（不含原藥材粉）根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定正式驗(yàn)證方法，預(yù)試驗(yàn)回收結(jié)果如下表： 菌 種 ( 代)批 號回收率%1ml0.5 ml0.2 ml0.1 ml大腸埃希菌（4）（1：10）2007010265

9、818191金黃色葡萄球菌（4）（1：10）200701020358994枯草芽孢桿菌（4）（1：10）200701020438393白色念珠菌（4）（1：10）200701028690/黑曲霉（4）（1：10）200701029190結(jié)果： 大腸埃希菌0.5ml以下/皿（1ml分注2個皿以上）回收均達(dá)到70%以上；枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌0.2ml以下/皿（1ml分注5個皿以上）回收均達(dá)到70%以上。白色念珠菌、黑曲霉按平皿法回收均達(dá)到70%以上。1. 計數(shù)方法驗(yàn)證：平皿稀釋法：大腸0.5ml/皿；金葡、枯草0.2ml/皿。白念、黑曲霉1ml/皿。（每個大組作1個批號樣品計數(shù)方法驗(yàn)證、控

10、制菌大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證）試驗(yàn)前準(zhǔn)備：各試驗(yàn)菌液（100-200cfu/ml）、1：10供試液、平皿、吸管等、BL增菌液試驗(yàn)組 菌液組（各2皿）、 供試品對照組0.5ml+大0.5ml（4皿） 大0.5ml 細(xì)0.2ml（6-10皿）0.2ml+金0.5ml（6皿） 金0.5ml 0.2ml+枯0.5ml（6皿） 枯0.5ml 1ml +白0.5ml（2皿） 白0.5ml 霉 1ml （2皿） 1ml +黑0.5ml（2皿） 黑0.5ml （ 共44皿，按規(guī)定培養(yǎng)、計數(shù)）（注：若所驗(yàn)證的計數(shù)方法成立，供試品對照組采用10個皿就同時完成該批號樣品細(xì)菌計數(shù)測定）2.大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)組

11、陰性菌對照組 供試品對照組BL 100ml BL 100ml BL 100ml10ml 1：10供試液 10ml 1：10供試液 10ml 1：10供試液+大腸10-100cfu +金葡10-100cfu 陰性對照：BL 100ml+稀釋劑10ml操作要點(diǎn)：1.2.同方法選擇預(yù)試驗(yàn)3. 正式驗(yàn)證各試驗(yàn)菌驗(yàn)證方法采用預(yù)試驗(yàn)結(jié)果中回收率在70%以上的方法進(jìn)行，最終以敏感菌方法確定計數(shù)方法；也可采用各菌的回收率均在70%以上的方法進(jìn)行。11.7上午離心沉淀集菌法、薄膜過濾法（反復(fù)使用集菌器）示教兩種方法可應(yīng)用于有抑菌活性的樣品，或與其他方法的聯(lián)用。離心500r/min3-5分鐘取上清液 + 平皿稀釋

12、法（細(xì)菌）、沉降+平皿稀釋法（霉菌、酵母菌），離心沉淀集菌法（3000r/min20分鐘）+平皿稀釋法、離心500r/min3-5分鐘上清液+薄膜過濾法（主要用于細(xì)菌計數(shù)驗(yàn)證）。離心機(jī)、刻度離心管（10ml、成對平衡）、吸頭、2ml刻度吸管離心500r/min3-5分鐘、離心沉淀集菌法（3000r/min20分鐘）的操作方法：500r/min3-5分鐘（用于細(xì)菌檢測）：取上清液的方法及要求（上清液不應(yīng)少于8ml，否則供試液應(yīng)適當(dāng)稀釋）；3000r/min20分鐘棄去上清方法及要求（留管底約2ml，當(dāng)離心沉淀物超過2ml時供試液應(yīng)適當(dāng)稀釋）。薄膜過濾法（反復(fù)使用集菌器）操作方法：1. 濾膜（不大于0.45um）的選擇及準(zhǔn)備：水溶性供試液水性膜：濾膜用水浸泡15分鐘后裝膜，12120分鐘滅菌，不烘干，短時間內(nèi)使；過濾前用稀釋液飽和濾膜。有機(jī)溶劑供試液有機(jī)濾膜：濾膜、濾器過濾前使充分干燥。2. 供試液、菌液的加入：將供試液或菌液加入一定量沖